Verzamelprotocol - Entomologie.indd

Verzamelprotocol DNA barcoding
Entomologie
Doel
Het verzamelde organisme wordt gebruikt om DNA uit te isoleren,
aan de hand waarvan een DNA barcode bepaald kan worden. Daarnaast
wordt het materiaal ook gefotografeerd. DNA extract en organisme (voucher)
zullen worden opgenomen in de collectie van NCB Naturalis. De DNA barcode
wordt, tezamen met de bijbehorende foto en collectiegegevens, gedeponeerd
in de publieke database van het internationale Barcoding of Life project
(www.boldsystems.org).
Wereldwijd is het doel om van elke soort van ten minste 10 exemplaren DNA
barcodes te bepalen. Als richtlijn voor Nederland houden we drie exemplaren
V9.0
per soort aan.
Verzamelprotocol - Entomologie.indd 1
02-03-11 10:53
Protocol
Stap 1: doden
Dood het dier door het direct over te brengen in een ruim volume 96% ethanol.
Bijv. enkele milliliters in een plastic 50 ml buis.
• Indien gebruik van 96% alcohol problematisch is, kan ook ethylacetaatdamp gebruikt worden; ga dan zodra het dier dood is door met stap 2.
Stap 2: subsampling
Breng een deel van het dode dier, bijv. een pootje (een zgn. subsample) over naar
een van de monsterbuisjes met 96% ethanol. Prepareer het resterende organisme
(de zgn. voucher) zo netjes mogelijk (i.v.m. fotografie) op de gebruikelijke wijze
gezien.
• Gebruik slechts (materiaal van) één exemplaar per buisje!
• Voorkom contaminatie tussen samples!
Stap 3: etiketteren
Voorzie zowel het monsterbuisje (met subsample) als de voucher van een van de
voorgedrukte etiketten met collectieregistratiecodes.
• Het etiket zonder matrixcode is bedoeld voor IN het monsterbuisje, het
bijbehorende etiket met matrixcode is voor bij de voucher.
• Belangrijk: de etiketten koppelen het sample aan de voucher. Gebruik dus voor
voucher en subsample etiketten met identieke collectieregistratiecodes.
Controleer!
Stap 4: invullen samplesheet
Geef in het bijgeleverde Excel-bestand SamplesheetBlank.xls aan welk sample in
welk buisje zit, door de gebruikte collectieregistratiecodes in te vullen. Gebruik bij
het opslaan van het bestand het nummer van het verzamelrekje als bestandsnaam.
Stap 5: invoeren registratiegegevens
Voer per sample de bijbehorende registratiegegevens in. Tenminste: collectieregistratiecode, taxon, determinator, verzamelaar, verzameldatum, land, plaats,
gebied, coördinaten.
• Gebruik het bijgeleverde Excel-bestand SampledataBlank.xls of lever de
gegevens aan als een exportbestand (.xml) uit Klasse.
• Belangrijk: de collectieregistratiecode koppelt de ingevoerde gegevens aan
het sample (en voucher). Voer deze dus zorgvuldig in. Controleer!
Stap 6: overdracht
Lever altijd tezamen aan:
• vol verzamelrekje (95 monsters), buisje H12 ontbreekt standaard (controle).
• samplesheet met positie-informatie (Excel-bestand).
• registratiegegevens in elektronisch vorm (in een apart Excel-bestand of
Klasse-export).
• bijbehorende voucher exemplaren (tenzij geen subsamples zijn genomen).
• indien van toepassing: ongebruikte etiketten met collectieregistratiecodes.
Verzamelprotocol - Entomologie.indd 2
02-03-11 10:53
Toelichting op protocol
DNA kan uit een grote verscheidenheid van weefsels geëxtraheerd worden.
Echter, factoren als de versheid, dodingsmethode en leeftijd van het sample
hebben allemaal effect op het succes van het verkrijgen van een goede
DNA barcode. Vers, ongeconserveerd weefsel is ideaal wanneer de omstandigheden het toestaan. ‘Natte’ weefsels vergaan zodra de cellen sterven. Wanneer
de cellen openbreken, lyseren, komen er enzymen vrij die DNA te lijf gaan.
In de regel geldt: hoe verser, hoe beter.
Bij stap 1
De dodingsmethode is van belang: sommige stoffen die traditioneel gebruikt
werden, zoals formaline, hebben een negatief effect op het DNA. Naast 96%
ethanol vormen bevriezen in vloeibare stikstof (flash-freezing), cyanide, ammonia
en ethylacetaat-damp mogelijke alternatieven. Bij gebruik van een van deze alternatieven dient men zo snel mogelijk door te gaan met stap 2 van het protocol.
Grootste nadeel van het gebruik van 96% ethanol is dat de dieren verstijven.
Dit bemoeilijkt prepareren, fotograferen en determineren. Doden in ethylacetaatdamp en binnen ~15 min overzetten op 96% vermindert het verstijven en lijkt
weinig effect te hebben op de kwaliteit van het DNA extract.
Bij stap 2
Subsampling
Geschikte weefsels voor subsampling
zijn pootjes, antennen of ander zacht
(spier)weefsel. Vermijd (de inhoud van)
het spijsverteringskanaal. Ongeveer
3 mm3 zacht weefsel volstaat. Vermijd
het gebruik van veel materiaal (niet meer dan 5 mm3). Om de (sub)samples in de
buisjes te stoppen kun je de meegeleverde verenstalen pincet gebruiken. Schaartje of horlogemakers pincet kunnen worden gebruikt om subsamples te nemen.
Let op! Voorkom contaminatie van de samples onderling (en besmetting met
humaan materiaal) door na elk genomen (sub)sample het gebruikte gereedschap goed te reinigen volgens een van deze methoden:
Verzamelprotocol - Entomologie.indd 3
02-03-11 10:53
a. zorgvuldig spoelen in ruim water en afnemen met een schone tissue;
b. afvlammen met een brander (of aansteker);
c.reinigen met chloorbleekwater (natriumhypochloriet-oplossing; 10% van
een commerciële oplossing), waarna alle bleek grondig weggespoeld dient
te worden om beschadiging van het DNA in de samples te voorkomen.
Voorkom dat de samples warmer worden dan 30°C en bewaar, waar mogelijk,
het rekje in de koelkast. Laat samples niet in de zon staan. In warmere streken is
het gebruik van koelelementen in het veld aan te raden.
De exemplaren waarvan de subsamples afkomstig zijn vormen de vouchers.
De vouchers dienen op de gebruikelijke wijze te worden geprepareerd en altijd
tegelijkertijd met de samples te worden aangeleverd!
Intacte dieren
Dieren kleiner dan ca. 5 mm kunnen, als alternatief voor subsampling, in hun
geheel worden aangeleverd voor een non-destructieve DNA extractie. Na afloop
daarvan kan het exemplaar alsnog als voucher worden gebruikt. Toepassing van
deze methode is alleen mogelijk na overleg vooraf met de Barcoding Faciliteit!
Let op! Subsamples en intacte dieren kunnen niet gecombineerd worden in
één verzamelrekje!
Verzamelprotocol - Entomologie.indd 4
02-03-11 10:53
Bij non-destructieve extracties is de DNA opbrengst lager. Er kan niet
gegarandeerd worden dat het exemplaar volledig onbeschadigd blijft.
Verzamelrekje
Het bijgeleverde verzamelrekje bevat 95 monsterbuisjes van 1,1 ml gevuld met
96% ethanol. Aan de onderzijde van elk buisje bevindt zich een alfanumerieke
codering, waarmee de positie in het doosje wordt aangegeven (A1 [rij A, kolom
1] tot en met H12 [rij H, kolom 12]). Het doosje zelf heeft een uniek nummer, op
de voorzijde weergegeven in cijfers en als barcode. Het laatste buisje (H12)
ontbreekt, hetgeen dient als negatieve controle.
Zorg er voor dat tijdens het werken het rekje in de juiste oriëntatie staat: met
positie A1 linksboven.
Let op! De buisjes dienen ingeleverd te worden op de correcte positie in het
verzamelrekje.
Verzamelprotocol - Entomologie.indd 5
02-03-11 10:53
Bij stap 3
Etiketten met collectieregistratiecodes zijn in tweevoud meegeleverd op stroken
alcoholbestendig katoenpapier. Het rechter etiket dient te worden uitgeknipt
langs de lijnen om in de monsterbuisjes te passen. Het linker etiket, voorzien
van een matrixcode, dient bij de voucher te worden gevoegd. In het geval van
non-destructieve extractie, wanneer er dus geen losse voucher is, dient dit etiket
geretourneerd te worden (zie stap 6).
Bij stap 4
Gebruik voor elke batch van 95 samples (een vol verzamelrekje) een nieuw
Excel-bestand (science.naturalis.nl/dnabarcoding). Het doel is te registreren
welk sample zich in welk buisje bevindt. Vul in de samplesheet het nummer
van het verzamelrekje, buisje en bijbehorende collectieregistratiecode in.
Voor gedetailleerde uitleg over het invullen van de samplesheet is een apart
tabblad bij­gevoegd in het bestand. Gebruik bij het opslaan van het bestand
het nummer van het rekje als bestandsnaam; bijvoorbeeld BCP1234001.xls.
Verzamelprotocol - Entomologie.indd 6
02-03-11 10:53
Bij stap 5
Gegevens van meerdere rekjes kunnen in een enkel bestand gecombineerd
worden. Coördinaten dienen te worden aangeleverd als geografische coördinaten (graden genoteerd met een decimale punt, WGS84, bijv. 52.165N 4.475E)
of, binnen Nederland, als RD coördinaten. Alleen in overleg kunnen coördinaten
ook in andere formaten worden aangeleverd, maar gebruik nooit meer dan
één formaat per kolom.
Bij Nederlands materiaal wordt het gebruik van Klasse (of Orde) als invoerprogramma op prijs gesteld (www.klasse-info.nl). Maak in dat geval voor elk
exemplaar een aparte vondst aan en vul de collectieregistratiecode in in het
veld ‘label’. Lever de gegevens aan in export-formaat (.xml).
Bij stap 6
Alcohol mag niet per post worden verzonden, overleg daarom met de contactpersoon over de handigste wijze van aanleveren.
Inhoud verzameltas
•1
verzamelrekje met 95 1,1 ml monsterbuisjes, gevuld met 96% ethanol,
afgesloten met een transparant-blauw schroefdopje met o-ring
• sleutel
•3
voor schroefdopjes
× 50 ml buizen met starand en schroefdop
• 250
ml 96% ethanol
• stroken
etiketten met collectieregistratiecodes (katoenpapier)
• horlogemakers
• verenstalen
pincet
pincet
• weefselschaartje
• papierschaar
• potlood
• doos
met tissues
Verzamelprotocol - Entomologie.indd 7
02-03-11 10:53
Barcode of life (BOL)
BOL is een internationaal initiatief (www.barcodeoflife.org), de Nederlandse
bijdrage wordt mogelijk gemaakt door het Fonds Economische Structuurversterking (FES).
De komende jaren zullen zo veel mogelijk Nederlandse soorten opnieuw worden
verzameld in samenwerking met PGO’s, verenigingen en terreinbeherende
instanties. Exemplaren worden gedetermineerd, gefotografeerd, gecatalogiseerd en in de collectie van NCB Naturalis opgenomen. DNA materiaal wordt
geëxtraheerd en bewaard (-80°C). DNA barcodes worden bepaald en aan de
publieke database (www.boldsystems.org) toegevoegd.
Contact
dnabarcoding@ncbnaturalis.nl
Sylviusweg 72, 2333 BE Leiden
www.science.naturalis.nl/dnabarcoding
Verzamelprotocol - Entomologie.indd 8
02-03-11 10:53