Inleiding - EuroStaete

DNA onderzoek
Welk type DNA
onderzoek?
• Is er DNA of RNA aanwezig?
• Is de DNA volgorde wel goed?
• Welk DNA is nu actief?
Welk type DNA
onderzoek?
• Is er DNA of RNA aanwezig?
• Is de DNA volgorde wel goed?
• Welk DNA is nu actief?
Is er DNA of RNA aanwezig?
• Principe:
• Van RNA eerst cDNA maken (RNA virus)
• DNA vermenigvuldigen tot een bepaalde
hoeveelheid kleur wordt gemeten.
• Geen kleur geen RNA / DNA,
• Veel kleur veel RNA of DNA (concentratie DNA is hier mee
te meten)
RNA DNA
CH3
Thymidine
Is er DNA aanwezig en ja hoeveel?
?
PCR
PCR
PCR
TaqMan PCR
Excitation
FRET
Amplicon
ANNEALING
EXTENSION
Amplicon
5’-3’ exonuclease
Emission
Reporter
Quencher
FRET (Fluorescence Resonance Energy
Transfer) using adjacent hybridization probes
FITC
Red 640
P
Excitation
FRET
Emission
P
Amplicon
Phosphate
Hardware
Real-Time PCR
5700
iCycler
Applied Biosystems
7700
Applied Biosystems
BioRad
LightCycler
Roche
FluorTracker
Stratagene
FluorImager
Molecular Dynamics
PCR quantitation
Microbial Load Testing
2.5
Threshold
Cycle
NEG
F2/F1
10
100
1.5
1000
10.000
100.000
1.000.000
0.5
0
10
20
30
40
Cycles
50
60
70
Threshold Cycle = 35 Load = 103.8 copies/ml
2.5
50
Test Sample
30
F2/F1
Threshold Cycle
40
20
Threshold
1.5
10
0
1
2
3
4
Concentration
5
Threshold Cycle
6
log 10
0.5
0
10
20
30
40
Cycles
50
60
70
PCR resultaten
Characterisation of HSV by melting curve
HSV
DNA pol
Primers common
to HSV 1 & 2
Hybridisation probes (to HSV-1)
HSV-1
no mismatch
Amplicon
HSV-2
mismatch
Melting Curve Analysis
HSV 1
55oC
HSV 2
HSV 2
HSV 1
HSV 1
67oC
HSV 2
73oC
HSV 1
HSV 2
HPV-DNA wel of niet aanwezig?
• HPV is dubbelstrengs DNA Virus
•Nodig?
•Automatisch extractie apparaat
•Real time PCR
Positieve uitslag HPV typeren door specifieke RT-PCRs in te zetten
DNA extractie-apparaat
• Beads die magnetisch zijn
• Aan deze beads plakken RNA en DNA
Kosten Baten HPV
• Biomek kosten
• LightCycler kosten
100.000 euro
50.000 euro
Per jaar afschrijven
Apparaatkosten per analyse
21.400 euro
3,6 euro
CTG per analyse
45 of 36 euro
Kosten Baten HPV
• Corbett extractie
• Corbett pipetteer station
• LightCycler kosten
30.000 euro
30.000 euro
30.000 euro
Per jaar afschrijven
Apparaatkosten per analyse
15.000 euro
2,5
euro
CTG per analyse
45 of 36 euro
Opbrengst en kosten HPV
• 6000 analyses
• 5% is positief
300 personen
• 300 HPV typering uitzoeken
• Kosten via DNA/RNA (CTG)
300 * 181 = 54.300 euro
• Zelf typeren loont.
• Sequencer kost per jaar 15.000 euro aan afschrijven
• en 2 euro per run
Is er RNA of DNA aanwezig?
•
•
•
•
•
•
•
•
•
S. aureus
S. pyogenes
S. pneumoniae
S. viridans groep
N. gonorrhoeae en meningitidis
H. influenzae
E. coli, Salmonella
Pseudomonas
MRSA
Is er RNA of DNA aanwezig?
•
•
•
•
•
•
•
•
•
S. aureus
S. pyogenes
S. pneumoniae
S. viridans groep
N gonorrhoeae en meningitidis
H. influenzae
E. coli, Salmonella
TOP 13 maken?
Pseudomonas
MRSA
Infectie ja of nee?
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
C
N
P
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
C
N
P
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
C
N
P
1
2
3
4
5
6
7
8
Pat. 1
Pat. 2
Pat. 3
Pat. 4
Uitslagen binnen 4 uur bekend
Welk type DNA onderzoek?
• Is er DNA of RNA aanwezig?
• Is de DNA volgorde wel goed?
• Welk DNA is nu actief?
DNA volgorde onderzoek
CF gen mutaties bij CF patiënten van Turkse of
Noordafrikaanse afkomst in Europa
Cystic Fibrosis (CF):
-
frequente aandoening bij mensen van
oorspronkelijk Europese afkomst
(in Nederland: 1 op 30 drager; 1 op 3600
pasgeborenen met CF)
-
ook bij mensen uit Turkije of Noord-Afrika,
bijvoorbeeld Marokko
(dragerschapsfrequentie niet goed bekend, geschat
circa 1 op 50)
Mutaties
156 CF patiënten uit geheel europa
-
46 verschillende mutaties vastgesteld,
-
F508del werd op 21.2 % van de allelen vastgesteld;
voor Nederland is dit 79%.
Sensitiviteit – neonatale screening (%)
OLA
Inno 19/17
Elucigene
CF 29
Nederlanders
99.0
99.0
99.0
99.0
Totaal (n=156)
60.9
55.8
61.5
60.3
-
Elucigene
CF 30
Percentage CF patiënten met tenminste één mutatie die
voorkomt in het panel van de betreffende DNA-analyse
methode.
- Lagere sensitiviteit voor Turken
Is uitbreiding van huidige testpanels met
meer CF mutaties gewenst?
1.
2.
Toevoeging van de 5 meest frequent genoemde mutaties
Toevoeging van nog 8 mutaties
Sensitiviteit (%)
Huidig
+5
+13
OLA
52.0
59.8
65.0
Inno 19/17
49.0
56.8
62.1
Elucigene CF 29
51.3
59.1
64.4
Elucigene CF 30
50.3
58.2
63.4
Is het verstandig om een test met een
dergelijke sensitiviteit aan te bieden?
1.
Voor preconceptionele of prenatale screening?
2.
Moet het aanbod etnisch-specifiek plaatsvinden?
3.
Als stap in de procedure voor neonatale screening?
Met de CF-screening worden veel patiënten gemist.
Dus het gehele gen bekijken?
Mutatie-analyse voor Hemofilie
en de Ziekte van von Willebrand
Mutaties in hemofilie A
1
7
14
18 22
26
FVIII
gene
MUTATIES
Van DNA naar mRNA
5x
cDNA, PCR en dan
volgorde bepalen
DNA volgorde bepalen
DNA volgorde bepalen
Electrokinetic Injection
Electrode (Cathode)
Capillary
Principle of Capillary
Electrophoresis
-
+
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
H
+
+
+
H H H
Fluorescent Signal Detection
Electrophoresis
• Laser beam generated by single argon laser split
to form dual pathway
• Split beam allows simultaneous illumination of 16
(4) capillaries from both sides of array at detection
cell
Laser
Energy
dye
+
CCD
• Fluorescence signal emitted from DNA fragments
at the detection cell are collected on CCD camera
:
Capillary Array:Detection Cell
Sequencing Data
Capillary Electrophoresis
Capillary Arrays
Different Length:
- 22 cm
- 36 cm
- 50 cm
- 80 cm
- 50 µm ID
- Non coated
- 100 runs warranty
Capillary Array and Polymer Combination
for Sequencing Applications
96-well plate assembly
(also available in 384-well format)
Plate retainer
Plate septa
Plate base
Sample plate
Autosampler Close-up
ABI PRISM® 3130xl Genetic Analyzer:
2 x 96 or 384 samples
3130 Genetic Analyzer:
1 x 96 or 384 samples
Sensors detects presence
and type of plate
Waste
1X running buffer
Water
Tray Cover
Workflow Diagram
Install Polymer Bottle
Prepare Samples
Load Plates
Schedule Runs
Start Run
Polymer Filling
Injection and
Electrophoresis
Auto Analysis
Auto Data
Extraction
Results
Genetic Analyzers
310
1
3130
4
3130xl
16
3730
3730xl
48
96
There is a solution for every need
SUMMARY: Sequencing Applications
Mutation Detection
Genotyping
(high density mutations,
e.g. VariantSEQr™Resequencing System)
Comparative
Sequencing
de novo Sequencing
Heterozygote
Analysis
Microbial Identification
(e.g. MicroSeq® Kits)
Epigenetics
(e.g. Methylation)
Comparative Genotyping
Gene Expression
(e.g. MLST)
(SAGE™)
Mutation Discovery
SUMMARY: Fragment Analysis
Applications
Mutation Screening
(e.g. SSCP, CSCE,...)
Screening for Loss of
Heterozygosity
Linkage
SNP Detection
(SNaPshot® kit &
SNPlex™ System)
Forensic, HID
Plant & Microbial Genomics
(e.g. AFLP® kit)
(Human and Mouse
LMS)
Animal Genotyping
(StockMarks® Kits)
Platform for
diagnostic applications
(via Celera Diagnostics/
Abbott partnership)
Fragment analyse (multiplex)
• Groot gen moet in fracties worden
opgedeeld
• Elke fractie heeft een verschillende lengte
• Deze kunnen in één run van elkaar worden
gescheiden.
Welk type DNA
onderzoek?
• Is er DNA of RNA aanwezig?
• Is de DNA volgorde wel goed?
• Welk DNA is nu actief?
Meerdere Genen tegelijk!
een droom-experiment
• in één enkel experiment bij een
cel vaststellen welke genen wel
en welke genen niet aan staan
– mens: 35.000 genen
• het is mogelijk...!
• DNA micro-arrays
– DNA chips
Gen activiteiten bij tumoren
hoe meet je de activiteit van
een gen?
RNA van gen 1
RNA van
gen 2
RNA van
gen 3
• alleen genen die aan staan
produceren RNA
• hoe meer RNA hoe groter
de aktiviteit van een gen
genexpressie meten aan de hand
van RNA concentratie in de cel
celtype 2
celtype 1
 vier mogelijkheden
•
•
•
•
genen
genen
genen
genen
even actief in beide celtypen
aktiever in één van de celtypes
actief in slechts één celtype
inactief in beide celtypen
componenten van de DNA
microarray technologie
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
• duizenden spotjes op
aan glaasje
• elk spotje heeft
stukjes DNA van een
specifiek gen
• 35.000 spotjes
genoeg voor alle
menselijke genen
– in principe...
microarray technologie
referentie cellen
*
**
* * * * *
isoleer RNA en maak
het fluorescerend GROEN
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
* **
*
isoleer RNA en maak
het fluorescerend ROOD
microarray technologie
referentie cellen
**
te analyseren cellen
* *
*
* *
*
specifieke binding van alleen de juiste
nucleotiden volgorde via dubbelstrengs
DNA: A-T en G-C...!
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
* *
* *
* **
*
microarray technologie
referentie cellen
**
1
2
3
4
5
6
*
*
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
* *
* **
*
alleen RNA van
referentie
cellen:
dus spot is
GROEN
microarray technologie
referentie cellen
**
1
2
3
4
5
6
*
*
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
* *
* **
*
microarray technologie
referentie cellen
**
te analyseren cellen
* *
*
* *
*
*
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
**
*
microarray technologie
referentie cellen
**
1
2
3
4
5
6
*
*
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
* *
alleen RNA van
te analyseren
cellen:
dus spot is
ROOD
microarray technologie
referentie cellen
te analyseren cellen
* *
**
*
*
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
* *
microarray technologie
referentie cellen
te analyseren cellen
* *
**
*
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
*
* *
microarray technologie
referentie cellen
**
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
RNA van
referentie
cellen en van
te analyseren
cellen:
GROEN plus
ROOD is GEEL
verband genexpressie en
fluorescentiesignaal
A B C D E F G
1
2
3
4
5
6
gen 1F
gen 3E
gen 5C
gen 5B
Genexpressie
celtype 1
celtype 2
-
++++
++
++++
++++
++
-
++++
-
-
-
microarray met DNA spots
van 7.500 genen van de muis
microarray met DNA spots
van 7.500 genen van de muis
DNA microarray om genen te
vinden in relatie tot een ziekte
gezond
ziek
isolatie
en
labelling
isolatie
en
labelling
microarray
binden aan microarray
spotjes meten
data extractie + analyse
identificatie van genen met andere activiteit bij ziekte
toepassing microarray diagnostiek
van borstkanker
traditionele diagnostiek
overlevenden
~30% patiënten overlijdt
aan borstkanker binnen 10 jaar
~70% overleeft 10 jaar of meer
tijd (jaren)
iedereen krijgt
chemotherapie...!
identificatie van genen waarvan de
activiteit verandert bij borstkanker
overlevenden
• analyse van
78 humane
borsttumoren
• 34 metastase-positief
binnen
5 jaar
– slechte prognose
tijd (jaren)
• 44 metastase-negatief
gedurende 5 jaar
– goede prognose
70 genen geïdentificeerd die verloop van het
ziekte goed kunnen voorspellen
78 tumoren
70 geselecteerde genen
goede prognose
slechte prognose
microarray classificatie
vs. NIH classificatie
5 % laag risico
95 % hoog risico
39 % laag risico
61 % hoog profiel
96%
74%
59%
klassieke NIH
classificatie
50%
classificatie op
basis van microarray
 classificatie van
158
borstkankertumoren
 minder onnodige
chemo-therapie
 identificatie van
genen die een
rol spelen bij
borstkanker
Excelbestand
DNA onderzoek
Is er RNA of DNA aanwezig
Is het DNA wel goed
Welk DNA is actief