University of Groningen Iron catalyzed oxidation chemistry Berg

University of Groningen
Iron catalyzed oxidation chemistry
Berg, Tieme Adriaan van den
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2008
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Berg, T. A. V. D. (2008). Iron catalyzed oxidation chemistry: from C-H bond activation to DNA cleavag
[Groningen]: University of Groningen
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
IJzer Gekatalyseerde Oxidatie Chemie; Van C-H-Binding Activatie tot DNA-Splitsing
Samenvatting
De in de natuur voorkomende verbinding (ijzer)bleomycine is in staat om DNA
(desoxyribonucleïnezuur, drager van alle erfelijke eigenschappen van alle levende wezens)
katalytisch te oxideren met behulp van moleculaire zuurstof (O2) als oxidant. Vanwege
deze eigenschap wordt het in de medische wereld gebruikt als een effectief antitumor
medicijn. Het achterliggend mechanisme berust op de eigenschap van ijzer bleomycine
(Fe(BLM)) om samen met moleculair zuurstof bepaalde interacties aan te gaan (activatie
van zuurstof) om reactieve ijzerbleomycine-deeltjes te vormen. Een belangrijk intermediair
dat gevormd kan worden is het ijzer(III)waterstofperoxido-complex ((BLM)FeIIIOOH), wat
beter bekend staat als ‘geactiveerd bleomycine’. Wat de exacte rol van dit intermediair is in
de oxidatie van DNA is tot op heden nog steeds niet exact bekend. Het kan zijn dat dit
deeltje direct verantwoordelijk is voor initiatie van het oxidatieproces, maar het is ook
aannemelijk dat het als uitgangsstof dient voor andere reactievere ijzerbleomycine
intermediairen. Wat wel duidelijk is, is dat dit gehele proces leidt tot oxidatie van één van
de twee DNA-strengen. Het geoxideerde DNA-product is verre van stabiel en door een
cascade van reacties valt de DNA-streng uiteen in twee stukken; de DNA-streng wordt als
het ware ‘geknipt’.
Het DNA-knipproces kan worden onderverdeeld in twee categorieën, namelijk een
‘enkelstrengs DNA-knipproces’ en een ‘dubbelstrengs DNA-knipproces’. De meeste
verbindingen, zowel natuurlijk of synthetisch van aard, zijn in staat om DNA te oxideren en
dus te knippen via een enkelstrengs DNA-knipproces. Dit houdt in dat de desbetreffende
verbinding slechts één van de twee DNA-strengen knipt. Slechts een handje vol
verbindingen (waaronder ijzerbleomycine) zijn in staat om ook een dubbelstrengs DNAknipproces te bewerkstelligen. In dit geval initieert de desbetreffende verbinding twee
enkelstrengse DNA-knippen op hetzelfde moment (of bijzonder kort na elkaar) op hetzelfde
punt in het DNA, maar in de tegenover elkaar liggende DNA-strengen. Deze
dubbelstrengse DNA-knippen zijn een interessant gegeven. In levende cellen kunnen
enkelstrengse DNA-knippen meestal gerepareerd worden door (enzymatische)
reparatiemechanismen, terwijl dit veelal bij dubbelstrengse DNA-knippen een stuk lastiger
is. Het gevolg is dat in veel gevallen de desbetreffende cel zal sterven. Dit is de reden dat
veel chemische verbindingen die dit dubbelstrengse DNA-knipproces kunnen
bewerkstelligen vaak gebruikt worden als medicijn tegen kanker. Bleomycine is daar een
van en wordt verkocht onder de productnaam Blenoxane®.
Het behoeft geen verdere toelichting dat veel wetenschappers bijzonder geïnteresseerd zijn
in de chemie die ijzerbleomycine vertoont. In de loop der jaren zijn er veel zogenaamde
‘modelmoleculen’ voor bleomycine ontwikkeld. In de eerste plaats kunnen deze
verbindingen worden gebruikt om bepaalde processen nader te bestuderen, bijvoorbeeld de
katalytische activering van zuurstof. Over het algemeen is dit gemakkelijker met
modelsystemen dan met bleomycine zelf. Daarnaast zijn er bij deze synthetische
verbindingen meer mogelijkheden om bepaalde aanpassingen in het molecuul te
introduceren. Het introduceren van kleine modificaties in het complex (bijvoorbeeld de
introductie van een extra functionele groep of juist het verwijderen van reeds aanwezige
functionaliteit) kan leiden tot grote veranderingen in eigenschappen van het desbetreffende
151
Samenvatting
complex. Hierbij kan bijvoorbeeld worden gedacht aan het bewust vertragen van een
bepaalde reactiestap om zo deze beter te kunnen bestuderen of juist versnellen van een
proces om op deze wijze een betere katalysator te krijgen voor een chemische
transformatie. Veel van de in de wetenschappelijke literatuur bekende katalysatoren zijn via
een dergelijke route verkregen en geoptimaliseerd.
In onze onderzoeksgroep is het molecuul N4Py ontwikkeld als een model voor bleomycine
(Figuur 1, links). Het blijkt dat het ijzercomplex van dit molecuul, Fe(N4Py) (Figuur 1,
midden) inderdaad over eigenschappen beschikt die gelijk zijn aan of vergelijkbaar zijn met
die van bleomycine. Allereerst kan met dit Fe(N4Py) complex ook een zogenaamd
ijzer(III)waterstofperoxido-intermediair worden gegenereerd ((N4Py)FeIIIOOH, ook wel
‘paars intermediair’ genoemd). Veel van de (spectroscopische) eigenschappen van dit
deeltje zijn vergelijkbaar met die van ‘geactiveerd bleomycine’ ((BLM)FeIIIOOH). Ook
blijkt Fe(N4Py) in staat te zijn om zuurstof te activeren en op deze wijze DNA te oxideren.
Een belangrijk verschil met ijzerbleomycine is echter dat alleen enkelstrengse DNAknippen worden verkregen met Fe(N4Py). Dit is ook het geval met nagenoeg alle in de
wetenschappelijke literatuur beschreven synthetische ijzercomplexen die ook in staat zijn
om DNA te oxideren. Een belangrijk onderdeel van het onderzoek beschreven in dit
proefschrift heeft zich gericht op het bewerkstelligen van een dubbelstrengs DNAknipproces met het Fe(N4Py)-complex. Daarnaast is gekeken naar hoe Fe(N4Py) in staat is
om zuurstof te activeren.
Figuur 1 Het ligand N4Py (links), Fe(N4Py) (complex 1, midden) en het Fe(N4Py)
complex met een covalent gebonden acridine functionaliteit (complex 2, rechts).
Er is een methode voorhanden om de hoeveelheid enkelstrengse en dubbelstrengse DNAknippen te kwantificeren. Hiervoor wordt een zogenaamd plasmide DNA gebruikt als
substraat in de reactie. Dit plasmide DNA is circulair en heeft een superhelische structuur;
de karakteristieke DNA-helix is ook nog eens een keer extra ‘opgedraaid’. Men zou dit
kunnen vergelijken met een telefoondraad dat in de war zit. Indien er één van de twee DNA
strengen van het plasmide DNA wordt geknipt, verdwijnt de superheliciteit en vormt het
plasmide DNA een gerelaxeerde circulaire structuur. Om de analogie met de telefoondraad
aan te houden; de draad zit niet meer in de war, maar is in de ‘normale’ toestand
teruggekeerd. Wanneer beide strengen van het plasmide DNA worden geknipt tegenover
elkaar (dubbelstrengse DNA-knip) wordt er lineair DNA gevormd.
De drie verschillende types DNA (superhelisch, circulair en lineair DNA) kunnen van
elkaar worden gescheiden door middel van gel elektroforese. Hierna wordt de DNA in de
gel gekleurd met ethidium-bromide en kan de relatieve hoeveelheid van elk van de drie
types DNA worden gekwantificeerd. Een belangrijk gegeven is dat het superhelisch DNA
minder ethidium-bromide opneemt. Hiervoor kan worden gecompenseerd door middel van
een correctiefactor. Deze correctiefactor is een unieke eigenschap van het gebruikte
plasmide DNA en verschilt dus voor elk plasmide DNA. Helaas hebben veel onderzoekers
dit niet onderkend, met als gevolg veel onbetrouwbare data in de wetenschappelijke
152
IJzer Gekatalyseerde Oxidatie Chemie; Van C-H-Binding Activatie tot DNA-Splitsing
literatuur. Van het plasmide DNA dat in dit onderzoek gebruikt is (pUC18 plasmide DNA)
is de correctiefactor bepaald op 1.31.
Het DNA-knipproces is een continu-proces, dat houdt in dat de activiteit niet afneemt nadat
er een knip in de DNA gezet is. Het is daarom goed mogelijk dat er een tweede knip gezet
wordt in de andere DNA-streng tegenover een al bestaande knip. Wanneer plasmide DNA
gebruikt wordt zal dus circulair DNA omgezet kunnen worden in lineair DNA, maar dit is
dan niet het gevolg van een dubbelstrengs DNA-knipproces. De hoeveelheid lineair DNA
die gevormd wordt via dit continue enkelstrengse DNA-knipproces kan worden
onderscheiden van de hoeveelheid lineair DNA dat gevormd is via een dubbelstrengs DNAknipproces. Door gebruik te maken van een statische analyse van de verkregen data is het
mogelijk om te discrimineren tussen deze beide processen.
Met deze methodologie is er gekeken naar het oxidatieproces van DNA door Fe(N4Py)
(complex 1, Figuur 1) en door Fe(N4Py) met een covalent gebonden acridine functionaliteit
complex 1, Figuur 1). Acridine is een bekende DNA-intercalator en heeft als functie om de
affiniteit van het ijzercomplex voor het DNA te verhogen. Het DNA-knippatroon is voor
beide complexen identiek; alleen enkelstrengse DNA-knippen worden geobserveerd. Wel
heeft het complex met de intercalator een viervoudig hogere reactiesnelheid.
Door additieven toe te voegen aan het reactiemengsel kan informatie worden verkregen
over mogelijke reactieve deeltjes die een rol spelen in de activering van zuurstof. Met name
superoxideradicalen blijken een belangrijke rol te hebben in de zuurstofactivering.
Alhoewel de naam doet vermoeden dat het hier om bijzonder reactieve deeltjes gaat, is het
niet waarschijnlijk dat deze deeltjes direct betrokken zijn in het oxidatieproces. Een meer
waarschijnlijke route is dat deze superoxideradicalen een interactie kunnen aangaan met het
Fe(N4Py)-complex. Op deze wijze kunnen andere reactieve intermediairen worden
gevormd die op hun beurt wel verantwoordelijk zijn voor het oxidatieproces van DNA.
Vervolgens werd geprobeerd om dubbelstrengse DNA-knippen te introduceren met behulp
van het Fe(N4Py)-complex. Hiertoe zijn twee enkelstrengs DNA-knippende Fe(N4Py)complexen aan elkaar gezet. Op deze wijze zijn nieuwe dinucleaire complexen verkregen,
waarbij twee Fe(N4Py)-eenheden via een variabele brug aan elkaar vast zitten. Het idee is
dat er twee enkelstrengse DNA-knippen op hetzelfde moment worden geplaatst in het
DNA. Als deze twee knippen plaatsvinden in beide DNA-strengen tegenover elkaar, kan
het gehele proces worden gezien als een dubbelstrengs DNA-knipproces. De algemene
structuur van de dinucleaire complexen is weergegeven in Figuur 2 (links).
Deze nieuwe dinucleaire complexen zijn getest op hun DNA-oxidatie-eigenschappen.
Enkele resultaten zijn te zien in Figuur 2 (rechts), waarin het aantal dubbelstrengse DNAknippen is uitgezet tegen het aantal enkelstrengse DNA-knippen. Wat opvalt, is dat er pas
in de loop van de reactie dubbelstrengse DNA-knippen worden gemaakt in het plasmide
DNA, maar niet in het begin van de reactie. Deze dubbelstrengse DNA-knippen zijn niet
het gevolg van twee onafhankelijke enkelstrengse DNA-knippen tegenover elkaar in het
DNA aangezien de data niet de theoretische lijn van een puur enkelstrengs DNAknipproces volgt. Een mogelijke verklaring hiervoor kan zijn dat de dinucleaire complexen
wel twee keer ruimtelijk gezien dicht bij elkaar knippen, maar dat door de superhelische
structuur van het DNA dit niet noodzakelijkerwijs dichtbij hoeft te zijn met betrekking tot
de exacte plaats in het DNA. Om deze hypothese te substantiëren zijn er experimenten
gedaan met gerelaxeerd circulair plasmide DNA als substraat. Met dit substraat worden er
vanaf het begin van de reactie al dubbelstrengse DNA-knippen geobserveerd met de
dinucleaire complexen.
153
Samenvatting
Figuur 2 Algemene structuur van de dinucleaire Fe(N4Py)-complexen (links) en de
gemiddelde hoeveelheid dubbelstrengse DNA-knippen per DNA molecuul (m)
uitgezet tegen de gemiddelde hoeveelheid enkelstrengse DNA-knippen per DNA
molecuul (n) van enkele dinucleaire Fe(N4Py)-complexen. De gestreepte lijn geeft
de theoretische hoeveelheid dubbelstrengse DNA-knippen aan die te verwachten
zijn met een zuiver enkelstrengs DNA-knipproces.
Verschillende dinucleaire complexen zijn getest op hun dubbelstrengs DNA-knip-activiteit
om knippen te introduceren in DNA. Het blijkt dat het weinig uitmaakt hoe de beide
metaalcomplexen met elkaar verbonden zijn. Zowel de afstand en de onderlinge oriëntatie
van de complexen hebben nauwelijks tot geen invloed op de uitkomst van de reactie.
Daarnaast is gekeken of de flexibiliteit van de brug tussen de metaalcentra zou kunnen
uitmaken, maar dit blijkt ook niet het geval. Alle geteste dinucleaire complexen laten een
nagenoeg identieke activiteit zien met betrekking tot dubbelstrengse DNA-oxidatie.
Vervolgens is onderzocht of een derde covalent gebonden metaalcentrum kan leiden tot een
hogere activiteit of tot een hogere hoeveelheid dubbelstrengse DNA-knippen. Twee van
deze trinucleaire complexen zijn met succes gesynthetiseerd en getest als katalysatoren in
de oxidatie van DNA. Een kleine, maar significante toename werd geobserveerd in de
hoeveelheid dubbelstrengse DNA-knippen in het plasmide DNA vergeleken met de
dinucleaire complexen. De toename was echter wel significant geringer in vergelijk met de
toename wanneer mononucleaire en dinucleaire Fe(N4Py)-complexen met elkaar
vergeleken worden. Ook is onderzocht of de introductie van een DNA-intercalator (zoals
acridine) bij de dinucleaire complexen een positieve uitwerking zou kunnen hebben op de
DNA knip activiteit (in analogie van de mononucleaire complexen). Twee dinucleaire
complexen met een covalent gebonden acridine functionaliteit zijn met succes
gesynthetiseerd. Het succes van de synthese werd echter overschaduwd door de slechte
activiteit van deze complexen in de oxidatie van DNA. De activiteit lag namelijk significant
lager dan de dinucleaire complexen zonder een DNA-intercalator. Het vermoeden bestaat
dat hier de onderlinge afstanden en oriëntatie tussen de beide metaalcentra en de
intercalator wel belangrijk zijn. Kennelijk is de structuur van de hier gesynthetiseerde
complexen nog niet optimaal.
Op basis van de huidige onderzoeksresultaten kan worden gesteld dat de dinucleaire
Fe(N4Py)-complexen in staat zijn om dubbelstrengse knippen te introduceren in DNA.
Daarnaast kan worden gesteld dat dit proces nauwelijks beïnvloed wordt door de structuur
van de dinucleaire complexen en door DNA-affiniteitsparameters (zoals een toegenomen
elektrostatische interactie met DNA (trinucleaire complexen) of DNA-intercalatie).
154
IJzer Gekatalyseerde Oxidatie Chemie; Van C-H-Binding Activatie tot DNA-Splitsing
Naast de oxidatie van DNA is ook de door Fe(N4Py) gekatalyseerde oxidatie van alkanen
bestudeerd, in het bijzonder de oxidatie van cyclohexaan naar cyclohexanol en
cyclohexanon. Deze testreactie is eerder in onze groep bestudeerd met Fe(N4Py) als
katalysator en waterstofperoxide (H2O2) als oxidant. Een belangrijke rol in deze was
weggelegd voor het eerder genoemde ‘paarse intermediair’, (N4Py)FeIIIOOH. Het is
voorgesteld dat dit deeltje een zogenaamde homolysereactie kan ondergaan om een
zogenaamd hoog-valent ijzer(IV)oxo-deeltje ((N4Py)FeIV=O) te vormen samen met een
bijzonder reactief hydroxylradicaal.
Een direct bewijs voor het bestaan van dit (N4Py)FeIV=O intermediair tijdens de oxidatie
van alkanen in acetonitril met H2O2 als oxidant was echter niet geleverd. Wel waren er
indirecte aanwijzingen dat hydroxylradicalen een grote rol speelden in het mechanisme.
Door hun bijzonder hoge reactiviteit verliep de oxidatie van cyclohexaan met weinig
productselectiviteit. Dat wil zeggen dat zowel cyclohexanol en cyclohexanon werden
gevormd. Mede ingegeven door nieuwe inzichten op deze materie, is het H2O2 vervangen
door meta-chloorperbenzoëzuur (mCPBA) als oxidant en is gevonden dat de
productselectiviteit van de alkaanoxidatie reacties significant verhoogd kunnen worden. Uit
een studie van de oxidatie van cyclohexaan, bleek dat er een significant hogere hoeveelheid
cyclohexanol werd gevormd dan cyclohexanon. Dit is een eerste indicatie dat er geen
hydroxylradicalen gevormd worden en dat een ander (selectief) deeltje verantwoordelijk is
voor het oxidatieproces. Ook andere experimentele data wijst in die richting, zoals een hoge
selectiviteit in adamantaanoxidatie en een hoog kinetisch isotoop effect. Deze resultaten
zouden kunnen duiden op de vorming van een (N4Py)FeIV=O intermediair tijdens de
reactie.
Met gebruik van een keur aan spectroscopische en spectrometrische methoden is vast
komen te staan dat het (N4Py)FeIV=O intermediair inderdaad gevormd wordt tijdens de
reactie. Mede op basis van deze resultaten in combinatie met kennis uit de
wetenschappelijke literatuur kan een voorstel worden gedaan voor een katalytische cyclus
voor de oxidatie van alkanen met mCPBA als oxidant (Schema 1).
Schema 1 Voorgestelde katalytische cyclus van Fe(N4Py) (complex 1) met mCPBA
als oxidant in de oxidatie van alkanen.
De belangrijkste rol van dit (N4Py)FeIV=O deeltje is de waterstofabstractie van het
substraat waarmee het oxidatieproces geïnitieerd wordt. Het ontstane alkyl radicaal kan
155
Samenvatting
vervolgens worden geoxideerd door een restant moleculair zuurstof, mCPBA of door
(N4Py)FeIV=O. Het ijzer(III)-deeltje, dat ontstaan is vanuit het (N4Py)FeIV=O na de
waterstofabstractie, kan nieuwe interactie aangaan met mCPBA om zo wederom een
(N4Py)FeIV=O deeltje te vormen en de katalytische cyclus te completeren.
Een belangrijk gegeven is dat de reactie moet worden uitgevoerd onder een inerte
atmosfeer. Het blijkt namelijk dat moleculaire zuurstof zorgt voor een deactivatie van de
katalysator en als gevolg hiervan voor een lage productselectiviteit en opbrengst. Wat exact
de achtergrond is van deze deactivatie van de katalysator is nog onbekend.
Het in dit proefschrift beschreven onderzoek heeft als doelstelling de oxidatieprocessen van
Fe(N4Py) te bestuderen, te beschrijven en te begrijpen. Met dinucleaire Fe(N4Py)complexen in plaats van mononucleaire complexen kunnen dubbelstrengse DNA-knippen
worden geïntroduceerd in het DNA. Op deze wijze bewijst het Fe(N4Py)-complex
wederom zijn waarde als een prima functioneel model voor de DNA-oxidatie activiteit van
ijzerbleomycine. In het door Fe(N4Py) geïnitieerde DNA-knipproces blijken
superoxideradicalen een belangrijke rol te spelen. Op het gebied van de katalytische
oxidatie van alkanen is vast komen te staan dat een hoog-valent ijzer(IV)oxo-deeltje een
belangrijke rol speelt in de katalytische cyclus. Ondanks deze geboekte voortgang blijven er
nog vele vragen over. Deze vragen zijn een belangrijke motivatie voor continuering van het
onderzoek naar één van de meest veelzijdige en actieve ijzerkatalysatoren in het veld van
de oxidatiechemie.
156