Methylatie profilering van HIV om de epigenetische

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2014-2015
Methylatie profilering van HIV om de
epigenetische regulatie van de latentie in kaart
te brengen
Sam Kint
Promotor: Prof. Dr. ir. Wim Van Criekinge
Tutor: Dr. Ward De Spiegelaere
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel-en genbiotechnologie
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2014-2015
Methylatie profilering van HIV om de
epigenetische regulatie van de latentie in kaart
te brengen
Sam Kint
Promotor: Prof. Dr. ir. Wim Van Criekinge
Tutor: Dr. Ward De Spiegelaere
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel-en genbiotechnologie
i
De auteur, de promotor en de tutor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik.
Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot
de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.
Promotor: Prof. Dr. Ir. Wim Van Criekinge
Tutor: Dr. Ward De Spiegelaere
Auteur: Sam Kint
ii
Woord vooraf
Meer dan een jaar geleden begon de zoektocht naar een thesisonderwerp. De lijst met
mogelijke onderwerpen en de thesisvoorstellingen tijdens de lessen konden me niet volledig bekoren, want ik wilde iets met virussen en/of epigenetica. Na enkele gesprekken met
verschillende proffen bleven er twee mogelijkheden over: elke dag naar de faculteit van de
diergeneeskunde voor HSV, of in Gent blijven voor HIV. Al snel koos ik voor de tweede
optie!
Deze masterproef schrijven was niet mogelijk geweest zonder de hulp van verschillende
mensen. Die mensen zou ik graag hartelijk bedanken voor alle hulp die ze mij hebben
geboden.
Om te beginnen bedank ik mijn promotor, Wim Van Criekinge. Zonder hem had ik dit
onderzoek niet kunnen voeren en door zijn enthousiasme had ik al na de eerste afspraak
zeer veel zin om aan mijn thesis te beginnen. Die goesting is nooit verdwenen!
Ook mijn co-promotor, Ward de Spiegelaere, wil ik bedanken. Gedurende het voorbije
jaar stond hij altijd klaar voor mij, hij stuurde mijn onderzoek in de juiste richting, nam
tijd om mijn teksten na te lezen,...
Verder wil ik de medewerkers van MDxHealth en NXTGNT danken, en in het bijzonder Hendrik, Johan en Joan, die me gedurende het hele jaar geholpen hebben met het
praktisch werk in het labo. Ook Geert zou ik graag bedanken voor zijn hulp met het
primerdesign, en voor de analyse van mijn sequencingresultaten. De medewerkers van de
HIV Translational Research Unit, en in het bijzonder Sofie, Marie-Angélique, Maja en
Wim wil ik ook bedanken. Zij zorgden ervoor dat ik steeds genoeg materiaal had om mijn
testen uit te voeren. Het werk dat zij voor mij in het labo hebben uitgevoerd, was van
onschatbare waarde voor mijn thesis.
Ten slotte wens ik mijn vrienden en familie te bedanken, die me elk op hun eigen manier
hebben geholpen, en tijd en energie hebben vrijgemaakt voor mijn thesis. In het bijzonder
dank ik daarvoor mijn ouders en grootouders, Charles, Thomas, Lieselot en Timo.
iii
iv
Samenvatting
Latentie van HIV-1 vormt op dit moment de grootste barrière om het virus definitief
uit het lichaam van een patiënt te elimineren. Het wordt gereguleerd door reversibele
epigenetische processen die ervoor zorgen dat, indien de patiënt stopt met Highly Active
Antiretroviral Therapy (HAART), de infectie gereactiveerd zal worden. Het is dus van
groot belang de onderliggende epimutaties die latentie induceren en onderhouden te ontdekken.
DNA-methylatie is een van de veel voorkomende epigenetische modificaties die voornamelijk voorkomt in CpG-eilanden. Deze modificatie wordt vaak gelinkt met silencing van
genen en wordt zelfs gezien als een van de afweermechanismen tegen retrovirussen. In vitro
werd al aangetoond dat DNA-methylatie in de CpG-eilanden in en rond het 5’-LTR van
het genoom van HIV-1 een belangrijke rol speelt bij latentie. De in vivo data zijn echter
minder eenduidig. Dit komt wellicht doordat het HIV-virus snel muteert en in de meeste
patiënten in zeer lage concentraties aanwezig is. Daardoor is het ontwikkelen van een degelijke betrouwbare assay om een methylatiepatroon op te stellen van patiëntenmateriaal
niet evident.
In dit onderzoek werd een assay ontwikkeld waarbij van het CpG-eiland NCR een methylatiepatroon kan worden opgesteld in zowel DNA-stalen afkomstig van SupT1-cellijnen,
CD4+ - en CD4- T-cellen uit een latentiemodel als van patiëntenstalen. Hierbij wordt
gebruik gemaakt van next generation deep sequencing waardoor er op korte tijd veel informatie kan worden verkregen. Door de ontwikkeling van deze assay kan in de toekomst
dus van grote groepen patiënten een methylatiepatroon worden bepaald, waardoor het
verband tussen de CpG-methylatie en de latentie van HIV-1 kan worden aangetoond.
v
vi
Inhoudsopgave
Woord vooraf
iii
Samenvatting
v
Lijst van afkortingen
ix
1 Inleiding
1.1 HIV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1 Classificatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2 Virionstructuur en genoom . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2.1 Virionstructuur . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2.2 Genoom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.3 Transmissie en Levenscyclus . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.3.1 Transmissie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.3.2 Levenscyclus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.4 Ziekteverloop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.4.1 Acute fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.4.2 Asymptomatische fase . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.4.3 Symptomatische fase . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.4.4 AIDS-fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.5 Virale latentie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.5.1 Pre-integratieve latentie . . . . . . . . . . . . . .
1.1.5.2 Post-integratieve latentie . . . . . . . . . . . . . .
1.1.6 Variabiliteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2 Epigenetica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.1 Epi-allelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.2 chromatine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.3 DNA-methylatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.3.1 CpG-methylatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.3.2 Analyse van DNA-methylatie . . . . . . . . . . .
1.2.3.2.1 Methoden gebaseerd op bisulfietconversie
1.3 Epigenetica en HIV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4 Onderzoeksvraag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
2
2
3
3
4
5
5
5
6
7
8
8
8
9
9
10
10
11
12
12
13
14
14
14
16
19
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
2 Materiaal en methoden
21
2.1 Primerdesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.1.1 Sense primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
vii
viii
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.1.2 Antisense primers . . . . . . . . . . . . . .
DNA-materiaal . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DNA extractie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
DNA concentratie . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bisulfietbehandeling . . . . . . . . . . . . . . . .
Polymerase Chain Reaction . . . . . . . . . . . .
2.6.1 standaard PCR . . . . . . . . . . . . . . .
2.6.2 droplet digital Polymerase Chain Reaction
Analyse van de PCR . . . . . . . . . . . . . . . .
sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Resultaten
3.1 SupT1 cellijnen .
3.2 Latentie model .
3.2.1 Coverage .
3.2.2 Methylatie
3.3 Patiënten . . . .
3.3.1 Coverage .
3.3.2 Methylatie
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
22
24
25
27
27
28
28
29
33
33
.
.
.
.
.
.
.
37
37
39
39
39
41
41
42
4 Discussie
47
4.1 Optimalisatie van de assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.2 Analyse van HIV-methylatie in vitro en in vivo . . . . . . . . . . . . . . . 51
5 Conclusie en verder onderzoek
57
Bibliografie
61
Addenda
69
Lijst van afkortingen
A
AIDS
AS
AS-LTR
AS-NCR
ASORF
ATP
bp
C
cDNA
CRFs
DC
ddPCR
DNA
DNMT
dNTP
dsDNA
ENV
ETR
G
gDNA
HAART
HIV
HTLV-III
LAV
LTNP
LTR
MSP
NCR
NK
PBMC
PCA
PCR
PIC
RNA
RRBS
adenine
Acquired Immunodeficiency Syndrome
antisense
Antisense Long Terminal Repeat
Antisense Non Coding Regions
Antisense Open Reading Frame
Adenosinetrifosfaat
base paren
cytosine
complement DNA
Circulating Recombinant Forms
Dendritische Cellen
droplet digital Polymerase Chain Reaction
Desoxyribonucleı̈nezuur
DNA Methyltransferase
deoxynucleoside Trifosfaat
dubbel strengig DNA
Envelop
Envelop, Tat, Rev
guanine
genomisch DNA
Highly Active Antiretroviral Therapy
Humaan Immunodefiëntie Virus
Human T-cell Leukemia Virus-III
Lymphadenopathy-Associated Virus
Long-Term Non-Progressors
Long Terminal Repeat
Methylation Specific PCR
Non Coding Region
Natural Killer
Peripheral Blood Mononuclear Cells
Principle Component Analysis
Polymerase Chain Reaction
Pre-Integratie Complex
Ribonucleı̈nezuur
Reduced Representation Bisulphite Sequencing
ix
x
RT
RTC
SAM
SBS
SIV
ssDNA
ssRNA
T
TCM
TH1
TH2
U
Reverse Transcriptase
Reverse Transcriptie Complex
S-Adenosyl-L-Methionine
Sequencing By Synthesis
Simian Immunodeficiency Virus
enkel strengig DNA
enkel-strengig RNA
thymine
Central Memory T-cells
T-Helper 1 cellen
T-Helper 2 cellen
uracyl
1.
Inleiding
De ziekte AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) is voor het eerst beschreven in
1981 en wordt veroorzaakt door Humaan Immunodefiëntie Virus (HIV) [1–3]. Eind 2013
waren er wereldwijd naar schatting 35 miljoen mensen die geı̈nfecteerd waren met HIV.
Datzelfde jaar werden er ongeveer 2.1 miljoen mensen besmet met het virus [4]. In 2013
noteerde het Wetenschappelijk Instituut van Volksgezondheid in België 1115 nieuwe diagnoses van HIV [5].
Het virus infecteert CD4+ T-lymfocyten en na de primaire, acute infectie onderdrukt het
immuunsysteem verdere replicatie, wat zal resulteren in een asymptomatische infectie [6].
Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART) is een combinatie van verschillende types antiretrovirale middelen, en zorgt ervoor dat de replicatie van HIV volledig stopt.
Daardoor blijft het virus latent aanwezig in de geı̈nfecteerde cellen. Deze latentie is
de voornaamste barrière voor de volledige eliminatie van het virus, waardoor de ziekte
tot op heden niet te genezen is [7, 8]. Mits een correcte inname van HAART heeft een
HIV-patiënt dezelfde levensverwachting als een niet-geı̈nfecteerd individu, maar door een
onregelmatige levensstijl of zelfs door bijgeloof of geloof in pseudo-geneeskunde is het
voor veel patiënten helemaal niet evident om levenslang dagelijks medicatie in te nemen.
Bovendien is de therapie zeer duur en heeft het een grote impact op de levenskwaliteit
doordat het veel bijwerkingen kan veroorzaken. Indien de therapie wordt stopgezet, zal
de replicatie van het virus terug starten en bijgevolg resulteert een infectie van HIV toch
vaak in Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), waarbij het immuunsysteem van
de patiënt onderdrukt wordt [6]. AIDS gaat gepaard met typische opportunistische infecties die moeilijk te controleren zijn, en uiteindelijk zal de patiënt overlijden aan de
gevolgen van deze infecties [9, 10].
Aangezien de latentie van HIV wordt gezien als een belangrijke barrière om het virus te
elimineren, is het van groot belang om de oorzaken van, en het mechanisme achter de
latentie te ontrafelen. Als men de oorzaken en het mechanisme kent, kan men specifieke
geneesmiddelen proberen ontwikkelen die de latentie ongedaan maken. In combinatie met
een therapie die de proliferatie van HIV verhindert, zou het virus wel kunnen geëlimineerd
worden [11, 12].
Nadat HIV een cel infecteert, wordt zijn genoom ad random geı̈ntegreerd in het chromosomaal Desoxyribonucleı̈nezuur (DNA) van de gastheercel [13, 14]. Eens ingebouwd
in het gastheergenoom is het virale DNA stabiel aanwezig in de cel, en kan het al dan
niet transcriptioneel actief worden. Na integratie wordt het virale genoom dus onderhevig
aan de cel-specifieke mechanismen van transcriptie en de repressie ervan [6, 14]. Epigenetica is de studie van de veranderingen in genexpressie of cellulair fenotype die niet zijn
veroorzaakt door veranderingen van de DNA-sequentie [15]. Activatie of inactivatie van
genen zijn processen die gereguleerd worden door dit fenomeen. Er is al aangetoond dat
1
2
epigenetische modificaties een invloed kunnen hebben op de activiteit van virale replicatie bij retrovirussen [16–19]. Ook de replicatie van HIV kan geactiveerd of geı̈nactiveerd
worden door epigenetica [20, 21]. Tijdens dit onderzoek trachten we te onderzoeken of
CpG-methylatie, een veel voorkomende epigenetische modificatie, bij patiënten al dan
niet de oorzaak is van virale latentie.
1.1
HIV
In 1981 werd AIDS voor het eerst erkend als ziekte [1]. De ziekte veroorzaakte bij homoseksuele mannen Kaposi’s sarcoom of de patiënt had last van opportunistische infecties met bijvoorbeeld Cryptococcus, Pneumocystis carinii, Toxoplasmose, Herpes simplex,
Cytomegalovirus, Candida of Cryptosporidium. Men dacht oorspronkelijk dat de ziekte
uitsluitend kon voorkomen bij homoseksuele mannen, maar al snel werd de groep van
vatbare personen uitgebreid met drugsverslaafden die intraveneus drugs gebruikten en
hemofiliepatiënten die een bloedtransfusie hadden ondergaan. In 1983 werd door de Belgische arts Nathan Clumeck voor het eerst geopperd dat de ziekte ook kon voorkomen
bij heteroseksuele Afrikaanse mannen die geen van bovenstaande risicofactoren vertoonden [22]. In datzelfde jaar werd een retrovirus geı̈soleerd dat als ziekteverwekker werd
gezien: Lymphadenopathy-Associated Virus (LAV) [2]. Niet veel later werd hetzelfde
virus door een andere onderzoeksgroep geı̈soleerd en daar kreeg het de naam Human
T-cell Leukemia Virus-III (HTLV-III) [3]. In 1984 werd door twee onafhankelijke Belgische onderzoeksgroepen besloten dat HIV ook door heteroseksueel contact kon worden
doorgegeven, en dat Afrika een broeihaard voor de ziekte vormde [23, 24]. Deze artikels
veroorzaakten veel ophef en de meningen van experten waren verdeeld. Uiteindelijk bleek
de Belgische visie over de verspreiding van het virus te kloppen. In 1985 werd bevestigd
dat LAV en HTLV-III hetzelfde virus zijn [25]. Later werd HIV gekozen als nieuwe naam
voor het LAV/HTLV-III [26].
1.1.1
Classificatie
HIV behoort tot het genus Lentivirinae van de familie van de Retroviridae. Een retrovirus is een RNA-virus waarbij het Ribonucleı̈nezuur (RNA)-genoom van het virion in een
geı̈nfecteerde gastheercel wordt omgezet tot DNA aan de hand van viraal enzym Reverse
Transcriptase (RT). Dat DNA kan vervolgens stabiel integreren in het gastheergenoom
als dubbel strengig DNA (dsDNA). Het genus Lentivirinae is een deel van de familie van
de Retroviridae en omvat virussen die een specifieke sferische virion morfologie hebben
met een cilindrische of conische kern [13]. Lenti betekent in het Latijn ’traag’, wat wil
zeggen dat het virus een infectie met een trage voortgang veroorzaakt.
HIV kan worden opgesplitst in twee types die allebei AIDS veroorzaken: HIV-1 en HIV2 [27,28]. Beide varianten zijn genetisch vrij verschillend, maar de transmissieroutes en de
gastheer zijn toch hetzelfde voor beide varianten (zie figuur 1 en sectie 1.1.3). HIV type
1 is wereldwijd verspreid, de progressie van de ziekte verloopt sneller en de transmissie
van het virus verloopt vlotter dan bij de HIV-2 variant [29–36]. HIV-2 komt voornamelijk
endemisch voor in West-Afrika. Bijgevolg ligt de focus van dit onderzoek op HIV-1.
3
Binnen HIV-1 bestaat er een zeer grote genetische variabiliteit (zie figuur 1 en sectie 1.1.6).
Deze variabiliteit uit zich in de verschillende groepen waarin HIV-1 wordt opgedeeld (M
is de Main-groep, O is de Outlier-groep en N is de Non-M-Non-O-groep). De M-groep
is de belangrijkste groep en in figuur 1 is te zien dat deze verder kan worden opgedeeld
in verschillende subtypes (A-D, F-H, J-K). Virussen van verschillende subtypes kunnen
onderling ook nog recombineren waardoor Circulating Recombinant Forms (CRFs) gevormd worden [37]. Subtype B is het meest voorkomend in West-Europa en Noord- en
Zuid-Amerika en bijgevolg is dit subtype het meest bestudeerd [38]. De focus binnen dit
onderzoek zal dan ook liggen op subtype B.
Figuur 1: Fylogenetische boom van lentivirussen die bij primaten voorkomen: HIV-1, HIV-2
en Simian Immunodeficiency Virus (SIV). Tussen HIV-1 en HIV-2 is er een zeer groot verschil,
maar ook tussen de groepen en subgroepen is er veel variatie. M is de Main-groep (subtype K
ontbreekt op deze figuur), O is de Outlier-groep, N is de non-M-non-O-groep [39].
1.1.2
Virionstructuur en genoom
1.1.2.1
Virionstructuur
Het virion van HIV-1 is sferisch, en heeft een diameter van ongeveer 110 nm (zie figuur
2) [40–42]. Het virus heeft een envelop die gevormd wordt uit het plasmamembraan van
de gastheercel. In deze envelop komen ongeveer tien glycoproteı̈ne trimeren voor die
opgebouwd zijn uit gp120 en gp41, maar er kunnen ook gastheer-specifieke eiwitten in
voorkomen. Tussen de envelop en de kern bevindt zich een matrix die voornamelijk is
opgebouwd uit het virale gag-eiwit p17. Een ander gag-eiwit (p24) is het belangrijkste
eiwit van het capsid dat het genoom omgeeft.
4
Figuur 2: Virionstructuur van HIV-1 [40]
1.1.2.2
Genoom
Als lid van de Retroviridae heeft HIV een RNA-genoom. Het genoom bestaat uit twee
identieke enkel-strengig RNA (ssRNA)-molecules die ongeveer 9.7 kb lang zijn. Dit RNA
wordt in de gastheercel omgezet tot DNA. Deze omzetting gebeurt door het virale enzym
Reverse Transcriptase (RT), dat zich samen met het genoom in het capsid bevindt (zie
figuur 2). Het gevormde DNA kan vervolgens integreren op een random locatie in het
genoom van de gastheer [13, 14].
Het virale genoom bevat volgende negen genen: gag, pol, vif, vpr, vpu, env, tat, rev en
nef (zie figuur 3) [43, 44]. gag, pol en env coderen voor structurele eiwitten die essentieel
zijn voor de productie van infectieuze viruspartikels. De andere zes genen coderen voor
primaire translatieproducten: twee regulatorische eiwitten (Tat en Rev) en vier accessorische eiwiten (Vif, Vpr, Vpu en Nef). De coderende regio van het virale DNA wordt
langs beide zijden geflankeerd door een identieke Long Terminal Repeat (LTR) van 634
base paren (bp). Het 5’-LTR bevat belangrijke regulatorische regio’s zoals de promotoren enhancerregio, de transcriptionele startregio en een regio voor de polyadenylatie [45,46].
Figuur 3: Het HIV-referentiegenoom HXB2 [47]
5
1.1.3
Transmissie en Levenscyclus
1.1.3.1
Transmissie
De transmissie van HIV gebeurt via duidelijk gedefinieerde routes [48]:
• Onbeschermd seksueel contact met een geı̈nfecteerde partner;
• Injectie of transfusie van gecontamineerd bloed of bloedproducten;
• Artificiële inseminatie, huidtransplantatie en orgaan transplantaties;
• Delen van niet gesteriliseerd injectiemateriaal dat gebruikt werd door een besmet
persoon;
• Overdracht van moeder naar kind tijdens zwangerschap, geboorte of borstvoeding.
1.1.3.2
Levenscyclus
De levenscyclus van HIV-1 is schematisch weergegeven in figuur 4.
Figuur 4: Schematische weergave van de levenscyclus van HIV-1 en de mechanismen in deze
cyclus waartegen de afzonderlijke medicijnen die voor HAART gebruikt worden kunnen inwerken (zie sectie 1.1.4.3). De coreceptor CCR5 kan ook CXCR4 zijn, en de ontmanteling die is
weergegeven op deze figuur geeft één van de drie mogelijke hypotheses weer [49].
De oppervlakte-eiwitten van HIV (gp120) herkennen CD4-receptoren op cellen van de
gastheer [42,49]. Typische cellen die door het virus worden geı̈nfecteerd zijn cellen van het
immuunsysteem die deze receptor op hun oppervlak tot uiting brengen zoals T-lymfocyten,
monocyten, Natural Killer (NK)-cellen, macrofagen, Dendritische Cellen (DC),... [6]. Na
de binding zal het gp120 oppervlakte-eiwit een conformatieverandering ondergaan waardoor de coreceptor-bindingssite vrijkomt [42, 49]. Door deze verandering kan het virus
6
binden aan de chemokine receptor CCR5 of CXCR4, die allebei als coreceptor kunnen
dienen. Deze tweede binding resulteert in de fusie van het plasmamembraan en de virale
envelop als gevolg van de insertie van het virale eiwit gp41 in het celmembraan [42,49,50].
Het virus kan de gastheercel vervolgens binnengaan.
Een volgende stap houdt in dat het capsid in het cytoplasma wordt ontmanteld, en dat
het virale genoom in het cytoplasma van de gastheercel wordt uitgestort. Vervolgens kan
reverse transcriptie doorgaan in het Reverse Transcriptie Complex (RTC) waarbij het
viraal RNA wordt omgezet in complement DNA (cDNA). Het gevormde Pre-Integratie
Complex (PIC) wordt vervolgens naar de nucleus van de cel gebracht, waar het in het
gastheergenoom kan worden geı̈ntegreerd [42, 49–51]. Er zijn echter recente aanwijzingen
dat het genoom van HIV niet meteen na het binnengaan in de gastheercel wordt uitgestort
in het cytoplasma, maar dat de capsid-eiwitten rond het RTC blijven tot aan de nucleus.
Tijdens het transport in het cytoplasma zal de reverse transcriptie doorgaan, terwijl de
capsid-eiwitten het virale genoom beschermen tegen afbraak in het cytoplasma. In de kern
degraderen de capsid-eiwitten en kan het PIC worden geı̈ntegreerd in het genoom [51,52].
Een derde model stelt voor dat de capsid eiwitten gradueel worden afgebroken tijdens het
transport naar de nucleus, en dat het gevormde PIC zonder capsid-eiwitten de nucleus
binnengaat voor integratie in het gastheergenoom [51].
Na de integratie van het genoom gebruikt de cel zijn transcriptie-, export- en translatiemechanismen om het viraal DNA om te zetten tot mRNA, dat mRNA naar het cytoplasma
te brengen en virale eiwitten te produceren. Deze eiwitten worden gebruikt om, samen
met RNA-kopijen van het volledige virusgenoom, nieuwe viruspartikels te vormen. Deze
partikels verlaten de gastheercel door een deel van het plasmamembraan mee te nemen als
envelop. Ten slotte worden nieuwe infectieuze viruspartikels gevormd door finale eiwitmodificaties aan te brengen op de structurele Gag-eiwitten met een protease enzym [49].
1.1.4
Ziekteverloop
Een HIV-infectie kan worden opgesplitst in vier fases: de acute fase (1.1.4.1), de asymptomatische fase (1.1.4.2), de symptomatische fase (1.1.4.3) en de AIDS-fase (1.1.4.4) (zie
figuur 5) [6]. De beschrijving van het ziekteverloop in secties 1.1.4.1 tot en met 1.1.4.4
geldt voor patiënten die geen therapie (HAART) ondergaan.
Het natuurlijke verloop van een HIV-infectie varieert sterk tussen patiënten. In normale
progressors en in de afwezigheid van therapie tegen HIV ontwikkelt de patiënt AIDS in
8-10 jaar [10, 53]. Er zijn echter patiënten (10-15%) die na twee tot vijf jaar al AIDS
krijgen. Deze patiënten worden de rapid progressors genoemd. Anderzijds zijn er ook de
Long-Term Non-Progressors (LTNP). Dit is een groep patiënten (<5%) die minimaal tien
jaar asymptomatisch blijven zonder medicatie [54]. Binnen de LTNP kunnen verschillende
types controllers onderscheiden worden: virus controllers zijn patiënten die zonder medicatie in staat zijn om de viraemie (viruspartikels in het bloed) laag, maar detecteerbaar
te houden. Elite controllers zijn patiënten die zonder medicatie de virustiters in het bloed
op een ondetecteerbaar niveau kunnen houden [55, 56].
7
Figuur 5: Het typische ziekteverloop van een HIV-infectie. Na de primaire infectie komen
in ongeveer 50% van de gevallen gedurende 6 tot 12 weken griepachtige symptomen voor. Dit
gaat gepaard met een piek van virale partikels in het bloed, en een dieptepunt van het aantal
CD4+ T-cellen. De daaropvolgende chronische fase duurt typisch 8 à 10 jaar waarbij de virale
replicatie een vrij constant niveau bereikt (setpoint viral load ). De laatste fase (AIDS-fase) is
geassocieerd met stijgende virale replicatie en dalende aantallen CD4+ T-cellen [57].
1.1.4.1
Acute fase
De acute fase vindt plaats tijdens de eerste weken na de besmetting met het virus en tijdens deze fase is de virusconcentratie in het perifeer bloed zeer hoog. Drie tot vier weken
na de infectie is er een piekmoment waarbij tot 108 HIV-1 RNA kopijen per ml plasma
kunnen voorkomen. Tegelijk daalt het aantal CD4+ T-cellen van 1200 cellen/µl bloed tot
onder 800 cellen/µl bloed [6,58]. Ongeveer 50% van de patiënten ervaart tijdens die eerste
weken van de infectie griepachtige symptomen zoals koorts, keelpijn, huiduitslag, misselijkheid,... De overige 50% van de patiënten zal geen symptomen ondervinden [44, 59, 60].
Zes tot acht weken na de besmetting treedt de cellulaire immuunrespons op en worden
de eerste HIV-specifieke antistoffen geproduceerd. Dit leidt tot een afname van virusconcentraties en tijdelijke toename van de CD4+ T-celconcentraties [6].
In dit stadium wordt een diagnose van HIV vaak gemist tenzij men op voorhand een
vermoeden had van een infectie.
8
1.1.4.2
Asymptomatische fase
De asymptomatische fase wordt ook de klinische latentiefase of chronische fase genoemd:
de patiënt ervaart geen symptomen van de HIV-infectie. Tijdens deze fase blijft het virus
wel nog aan een constante snelheid repliceren in de lymfeknopen en vindt er een snelle
turnover plaats van plasma virions en CD4+ T-cellen [61–64]. Door de continue virale
replicatie in CD4+ T-cellen is het onmogelijk om de volledige populatie van deze cellen
te regenereren. Dit heeft een graduele afname van de functionaliteit van het immuunsysteem als gevolg. De virale replicatie kan door het immuunsysteem vertraagd worden,
en wordt geholpen door specifieke mechanismen die de klinische latentie stimuleren: een
lage expressie van CCR5 (cofactor voor fusie) op de gastheercel [65], een lage hoeveelheid
cellulaire deoxynucleoside Trifosfaat (dNTP) voorzien voor retrotranscriptie en weinig
Adenosinetrifosfaat (ATP) voorzien voor transport van het cDNA naar de nucleus [66,67].
1.1.4.3
Symptomatische fase
Als het aantal CD4+ T-cellen daalt tot minder dan 500 cellen/µl bloed, zal de patiënt
last beginnen krijgen van opportunistische infecties. Doordat het immuunsysteem verzwakt is, is het niet meer in staat om die infecties efficiënt te bestrijden [6]. In Europa
en de VSA is 500 CD4+ T cellen/µl bloed de aangeraden grens om antiretrovirale therapie (Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART)) te overwegen. Tussen 350 en 500
CD4+ T-cellen/µl wordt therapie in een aantal gevallen aangeraden. Onder 350 CD4+
T-cellen/µl wordt therapie altijd sterk aangeraden [68, 69]. Deze therapie onderdrukt
de virale replicatie door gelijktijdig in te werken op verschillende punten van de replicatiecyclus: HAART kan aanhechting, fusie, reverse transcriptase, protease en integrase
inhiberen (zie figuur 4) [49,70]. Dit zorgt ervoor dat de mortaliteit significant daalt en dat
de levenskwaliteit van de patiënten sterk toeneemt [71, 72]. Doordat een combinatie van
typisch 3 verschillende medicijnen toegediend wordt, is de kans dat er resistentie optreedt
tegen de therapie zeer klein. Experten pleiten er tegenwoordig echter voor om de therapie
al zo vroeg mogelijk op te starten [73]. Op die manier daalt de kans dat de patiënt andere
individuen zal infecteren en kan het virale reservoir binnen de patiënt kleiner gehouden
worden. Bovendien werd in recent onderzoek aangetoond dat de kans op het ontwikkelen
van AIDS, maar ook kanker, leverziekten,... sterk afneemt door een vroege toediening van
HAART [73, 74]. Daardoor lijken de huidige richtlijnen voor het toedienen van antiretrovirale middelen bij een HIV-infectie achterhaald.
Hoewel HIV efficiënt kan onderdrukt worden met HAART, is het tot op heden nog niet
mogelijk om het virus volledig te elimineren. Dit is voornamelijk te wijten aan de virale
latentie (zie sectie 1.1.5).
De symptomatische fase wordt vaak als één fase gezien met de AIDS-fase.
1.1.4.4
AIDS-fase
Zonder therapie krijgen nagenoeg alle patiënten na verloop van tijd AIDS [6]. Men spreekt
van AIDS van zodra het aantal CD4+ T cellen lager is dan 200 cellen/µl bloed. In
deze fase treedt er volledige immunodeficiëntie op en is het immuunsysteem niet meer
in staat om het virus te controleren. De patiënt zal typische opportunistische infecties
9
zoals Pneumocystis carinii, Candida,... oplopen en/of Kaposi’s sarcomen en lymfomen
ontwikkelen. De AIDS-fase resulteert uiteindelijk in de dood van de patiënt. Dankzij de
effectieve werking van HAART is het mogelijk ervoor te zorgen dat de patiënt nooit in de
AIDS-fase terecht komt. De replicatie van het virus wordt dan zodanig onderdrukt dat
HIV niet de mogelijkheid heeft om het aantal CD4+ T-cellen tot 200 cellen/µl bloed of
lager te brengen. Bijgevolg hebben HIV-patiënten mits correcte inname van de medicatie
dezelfde levensverwachtingen als personen die niet zijn geı̈nfecteerd.
1.1.5
Virale latentie
Virale of cellulaire latentie is niet hetzelfde als klinische latentie. Klinische latentie (zie
ook sectie 1.1.4.2) betekent dat de patiënt geen symptomen van de infectie ondervindt,
maar het virus zal in het lichaam (bv. in de lymfeknopen) wel nog repliceren [75]. Virale
latentie slaat op stabiele aanwezigheid van het virus in de nucleus van de gastheercel,
maar in afwezigheid van replicatie. Het virus kan in een later stadium wel worden gereactiveerd [76]. Deze vorm van latentie heeft als gevolg dat er een reservoir van provirussen
kan worden gevormd. Deze provirussen kunnen door het immuunsysteem niet worden
gedetecteerd, maar ze kunnen de patiënt op een later tijdstip wel nog ziek maken indien
ze gereactiveerd worden. Dit reservoir bevindt zich voornamelijk in naı̈eve T-lymfocyten
en geheugen T-lymfocyten en wordt groter naarmate de ziekte langer aansleept [77, 78].
Virale latentie is de voornaamste reden dat HIV niet kan worden geëlimineerd uit het
lichaam en dus waardoor HIV een chronische infectie veroorzaakt.
Er zijn twee verschillende types van virale latentie beschreven voor HIV-1: pre-integratieve
latentie en post-integratieve latentie.
1.1.5.1
Pre-integratieve latentie
Bij pre-integratieve latentie infecteert het virus een rustende cel [79, 80]. Het virale genoom zal wel worden omgezet tot DNA en naar de kern worden getransporteerd, maar de
integratie in het DNA van de gastheer zal niet doorgaan [81–83]. Het proviraal DNA komt
dan voor als lineair of circulair dsDNA in de kern van T-cellen die zich in de G0 -fase van
de ontwikkeling bevinden. Aangezien het niet wordt geı̈ntegreerd in het gastheergenoom,
heeft dit proviraal DNA een korte halfwaardetijd van enkele uren tot dagen [79, 80]. Dit
extrachromosomaal DNA zou in sommige gevallen kunnen dienen als competente template voor virale replicatie [84].
Aangezien CD4+ T-cellen in patiënten normaal in rustende staat voorkomen, is preintegratieve latentie een veel voorkomend fenomeen in geı̈nfecteerde individuen. Het
lineair dsDNA kan, als gevolg van celactivatie, toch geı̈ntegreerd worden in het gastheergenoom [85, 86]. Deze vorm van HIV-DNA wordt daardoor beschouwd als een potentiële
bron van het virale reservoir [85]. Gezien de korte halfwaardetijd van het lineaire dsDNA
in vergelijking met de geschatte tijd voor een celdeling van een T cel (een geheugen T-cel
deelt gemiddeld om de 22 weken, een naı̈eve T-cel deelt gemiddeld om de 3.5 jaar [87]),
wordt deze vorm van latentie eerder gezien als een zwakke, transiënte bron van het viraal
reservoir [87, 88].
10
1.1.5.2
Post-integratieve latentie
De tweede vorm van latentie houdt in dat de integratie in het gastheergenoom wel plaatsvond, maar dat er geen virale replicatie plaatsvindt [89, 90]. Studies tonen aan dat cellen
met latente provirale genomen 10 tot 100 keer meer voorkomen dan cellen met actief
replicerende provirussen [91]. Dit latentiemechanisme is zeer stabiel, en wordt eerder verantwoordelijk geacht voor het onderhouden van een cellulair reservoir van HIV-1. Indien
defectieve en replicatie-incompetente HIV-genomen geı̈ntegreerd worden zal er ook latentie optreden, maar deze provirussen zijn uiteraard niet in staat om nieuwe cellen te infecteren. De meeste CD4+ T-cellen die latent zijn geı̈nfecteerd hebben replicatie-competente
provirussen in hun genoom. Toch zullen ze geen HIV-1 replicatie vervolledigen tot als
de cellen geactiveerd worden [92, 93]. De persistentie van de latent geı̈nfecteerde CD4+
T-cellen zorgt ervoor dat het tot op heden onmogelijk is om een HIV-1 infectie volledig
uit het lichaam te verwijderen [94]. De huidige therapie (HAART) tegen HIV focust dan
ook op het vertragen of zelfs onderbreken van de replicatie van het virus. Dit heeft enkel
een vertraging van de voortgang, maar geen genezing van de ziekte als gevolg.
De oorzaak van de post-integratieve latentie van HIV is niet gekend. Bij andere retrovirussen is al beschreven dat latentie veroorzaakt wordt door CpG-methylatie van de
5’-LTR-regio (zie secties 1.2 en 1.3) [17,18,95–100]. Voor HIV is dit ook al aangetoond in
cellijnen en latentiemodellen [20, 21, 76, 101–109], maar er zijn voorlopig nog maar weinig
data van in vivo CpG-methylatie van de 5’-LTR [110]. Onder andere door de variabiliteit
van HIV (zie sectie 1.1.6) en door de lage virusconcentratie in het bloed van de meeste
patiënten is het moeilijk om veel data te genereren, en deze resultaten zijn vaak tegenstrijdig [107, 110–112]. Er zijn ook studies die aantonen dat de virale latentie van HIV
veroorzaakt zou kunnen worden door andere factoren dan CpG-methylatie zoals modificatie van de histoncode en van de chromatinestructuur op de plaats waar het provirus
wordt geı̈ntegreerd [113–120]; de locatie waar het provirus integreert in het gastheergenoom [14,121,122]; de afwezigheid van transcriptionele activators voor HIV-1 genexpressie
in de gastheercel [123–126]; de aanwezigheid van transcriptionele repressors [117, 119]; falen van transcriptionele elongatie of van correcte splicing [86].
Er is dus een grote kans dat de latentie van HIV gereguleerd wordt door verschillende
factoren, en dat CpG-methylatie slechts een stap is in een reeks van processen die de
latentie veroorzaken [93, 108], of dat CpG-methylatie enkel de stabiliteit van de latentie
controleert [107]. Deze multifactoriële oorzaak zou het onderzoek naar de latentiemechanismen, en bijgevolg de weg naar een efficiënt medicijn om HIV te elimineren, zeer
moeilijk kunnen maken [127].
1.1.6
Variabiliteit
Binnen de subtypes (zie sectie 1.1.1) is er nog steeds een zeer grote genetische diversiteit.
Deze variabiliteit wordt veroorzaakt door een combinatie van verschillende factoren: hoge
mutatiesnelheid, snelle virale productie, recombinatie en selectie. Het virale RNA wordt
door Reverse Transcriptase (RT) omgezet tot DNA, maar bij deze omzetting is er geen
mogelijkheid tot proofreading. Door dit gebrek aan proofreading gebeuren veel substituties, en in mindere mate inserties en deleties. RT heeft een foutfrequentie van ongeveer
11
3.4x10-5 mutaties per bp per replicatiecyclus [128]. Aangezien het HIV-genoom ongeveer
104 bp lang is, en de virale basisproductie van HIV ongeveer 1010 virions per dag bedraagt,
worden er dagelijks miljoenen varianten van HIV geproduceerd in een patiënt [129]. Indien
er verschillende virusvarianten repliceren in één cel, kan de diversiteit nog verder stijgen
als gevolg van recombinatie [130]. Hoewel de meeste van deze mutaties vrij dramatische
gevolgen hebben voor HIV, kan de viruspopulatie binnen een patiënt toch evolueren van
een homogene tot een complexe heterogene populatie (quasispecies) [131]. Daarbij komen
binnen een asymptomatische patiënt gemakkelijk meer dan 106 genetische varianten voor
in zijn/haar reservoir [132].
Indien de mutaties plaatsvinden op structurele eiwitten van het virus, zullen verschillende
mutanten andere eiwitten uitdrukken op hun envelop. Dit heeft als gevolg dat het immuunsysteem van de patiënt telkens nieuwe antistoffen moet produceren, en dat de virale
replicatie moeilijk onder controle te houden is [6]. Door het immuunsysteem en door de
toediening van HAART, zal het virus selectiedruk ondervinden [133]. Dit resulteert in
een tragere replicatie van HIV en dus een tragere evolutie. Toch zal de virale diversiteit
blijven groeien, en na enige tijd kan er resistentie tegen de antiretrovirale therapie in een
deel van de virale populatie optreden [134, 135]. Doordat bij HAART typisch drie verschillende medicijnen samen worden toegediend, is de kans op resistentie tegen de therapie
echter zeer klein.
1.2
Epigenetica
De term epigenetica werd voor het eerst voorgesteld in 1942 door Waddington en is afgeleid van ’epigenesis’ [136,137]. ’Epi’ betekent ’boven’ of ’over’, genetica impliceert dat het
te maken heeft met genen. Het betekent dus letterlijk ’bovenop genetica’. Epigenetica
werd door Waddington beschreven als ”the branch of biology which studies the causal interactions between genes and their products, which bring the phenotype into being” [136].
Er zijn verschillende mechanismen die de genactiviteit van een complex organisme controleren en reguleren. Daardoor zijn genetische en fenotypische variatie vaak niet gekoppeld:
er ontstaan situaties waarbij genetische variatie niet leidt tot fenotypische veranderingen,
of waarbij fenotypische veranderingen niet het gevolg zijn van genetische variatie. De
complexe relatie tussen geno- en fenotype was volgens Waddington te wijten aan complexe interacties tussen genen onderling, aan de plasticiteit van de genen en aan invloeden
uit de omgeving van het organisme [137].
In 1990 stelde Holliday een meer moleculaire definitie voor: ”De studie van mechanismen
van tijdelijke en ruimtelijke controle van de genactiviteit tijdens de ontwikkeling van complexe organismen” [138]. Epigenetica legt als het ware een additionele laag informatie op
de DNA-code. Deze laag is reversibel, maar vaak zeer stabiel aanwezig op het genoom.
Vier jaar later definieerde Holliday epigenetica als: ”de studie van veranderingen in genexpressie die voorkomen in organismen met gedifferentieerde cellen, en van de mitotische
overerfbaarheid van bepaalde patronen van genexpressie” [15]. Epigenetica is nucleaire
overerfbaarheid die niet gebaseerd is op verschillen in de DNA-sequentie.
12
Het is niet eenvoudig een sluitende definitie van epigenetica te formuleren. In de brede zin
kan het gezien worden als een brug tussen genotype en fenotype: een fenomeen dat het
finale resultaat van de expressie van een locus of een chromosoom (het fenotype) van een
cel verandert, zonder de onderliggende DNA-sequentie (het genotype) te veranderen [139].
1.2.1
Epi-allelen
Epi-allelen (epigenetische allelen) zijn genomische regio’s waarvan de epigenetische status
varieert tussen verschillende individuen binnen een populatie [140]. Met andere woorden, het zijn mitotisch overerfbare vormen van genen waarbij de expressie varieert, maar
de verschillen worden niet veroorzaakt door andere DNA-sequenties. Epi-allelen worden
gevormd door een of meer epigenetische modificaties zoals DNA-methylatie, histonmodificaties, chromatine-modificerende factoren, post-translationele modificaties van eiwitten,... [139]. Deze modificaties zijn het gevolg van de samenkomst van genetische invloeden, omgevingsfactoren en toevallige gebeurtenissen [140]. Door deze verschillende
invloeden wordt er een toenemende plasticiteit gevormd waardoor een vast genotype verschillende fenotypes kan veroorzaken [140, 141].
Epigenetische modificaties kunnen er voor zorgen dat bepaalde genen al dan niet tot
expressie komen in een bepaalde cel [141]. Door de verschillende epi-allelen is het dus
mogelijk om ervoor te zorgen dat uit één zygote met een uniek genoom een complex
organisme kan gevormd worden met cellen die een verschillende morfologie en functie
vertonen. De differentiatie van de cellen en weefsels van een complex organisme is dus
per definitie een epigenetisch proces. Naast differentiatie van cellen en de ontwikkeling
van een complex organisme speelt epigenetica ook een rol in andere toepassingen zoals
veroudering, ontwikkeling van bepaalde ziektes als diabetes, bescherming tegen bepaalde
genomische parasieten,... [16, 19].
1.2.2
chromatine
In een celkern komt DNA voor in een condense vorm, chromatine. Dit is een complex
van DNA en histonen [142–144]. De basiseenheid van chromatine is het ’nucleosoom’,
een ’parel’ waarbij ongeveer 200 bp DNA rond een histon-octameer gewikkeld zijn. Als
gevolg van epigenetische modificaties op de histonen en het DNA (zie sectie 1.2.1) kan de
compactheid van het chromatine aangepast worden [145, 146]. De chromatinestructuur
(voornamelijk de compactheid) is een directe oorzaak van de (in)activatie van genexpressie bij eukaryote cellen [146, 147].
Euchromatine (niet-compact chromatine) bevat genen die kunnen afgeschreven worden.
Deze regio’s bevatten meestal actieve genen. Heterochromatine (compact chromatine)
bevat genen die niet kunnen worden afgeschreven aangezien de transcriptiecomplexen
geen vlotte toegang hebben tot het DNA. Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen constitutief en facultatief heterochromatine [148]. Het eerste is continu compact, en
wordt nooit afgeschreven. Deze regio’s worden typisch teruggevonden in centromeren
en telomeren, voornamelijk in repetitieve sequenties. Bij het tweede is de compactheid
afhankelijk van epigenetische modificaties die gereguleerd worden door de weefseltypes,
levensomstandigheden, externe factoren, hormonen,...
13
1.2.3
DNA-methylatie
Een van de veel voorkomende epigenetische modificaties is DNA-methylatie. Dit is een
proces waarbij op de C-5 positie van een cytosine (C) een methylgroep covalent wordt
gebonden (zie figuur 6). Deze binding wordt gekatalyseerd door het enzym DNA Methyltransferase (DNMT) met S-Adenosyl-L-Methionine (SAM) als substraat [149].
Figuur 6: Het proces van DNA methylatie. Op de C-5 positie van C wordt, gekatalyseerd door
DNMT-1, een methylgroep covalent gebonden.
Op het humane genoom worden bijna uitsluitend C-residu’s van CG-dinucleotiden gemethyleerd [150]. Deze CpG-methylatie is een overerfbare, reversibele epigenetische modificatie die van belang is bij verschillende biologische processen in dieren, maar ook in
planten en fungi [151]. In zoogdieren is DNA-methylatie van belang voor normale embryologische ontwikkeling, regulatie van genexpressie, X-chromosoominactivatie, genomische
imprinting, chromatinemodificatie, genetische ziekten, carcinogenese, silencen van endogene retrovirussen,... [152–154]. DNA-methylatie gebeurt niet ad random, maar volgens
een karakteristiek patroon voor elk celtype. Indien DNA-methylatie plaatsvindt in een
promotorregio van een gen, veroorzaakt het typisch transcriptionele silencing (inactivatie) van dat gen [154–156]. Het patroon van de DNA-methylatie kan namelijk een invloed
uitoefenen op het al dan niet doorgaan van bepaalde histonmodificaties, die op hun beurt
de chromatinestructuur kunnen beı̈nvloeden [157]. Indien genen enkel geı̈nactiveerd worden door histon modificaties, wordt deze inactivatie eerder gezien als een labiele repressie,
terwijl inactivatie geı̈nduceerd door een achterliggend mechanisme zoals DNA-methylatie,
wordt gezien als een heel stabiele silencing. Methylatie kan ook plaatsvinden binnen in
de genen, maar de functie van dit type methylatie is minder eenduidig. Het wordt wel
geassocieerd met bepaalde biologische functies zoals regulatie van splicing, silencing van
transposons,... [158, 159].
Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen postreplicatieve onderhoudsmethylatie en
de novo methylatie. Het eerste mechanisme kan CG-dinucleotiden na replicatie efficiënt
methyleren als de oorspronkelijke streng ook gemethyleerd was. Deze methylatie wordt
gekatalyseerd door DNMT-1 [153, 160]. Bij het laatste mechanisme worden onder invloed
van DNMT-3a en DNMT-3b methylgroepen getransfereerd naar ongemethyleerd DNA,
onafhankelijk van replicatie [152]. De novo methylatie wordt vaak in verband gebracht
met een beschermingsmechanisme tegen virussen (zie sectie 1.3).
14
1.2.3.1
CpG-methylatie
CpG-dinucleotiden komen meestal slechts in 1/4 tot 1/3 van de verwachte frequentie voor.
Dit fenomeen noemt men CpG-suppressie [161, 162], en is het resultaat van verschillende
factoren [109]. Toch zijn er bepaalde regio’s die meer CpG-dinucleotiden bevatten dan
statistisch verwacht: CpG-eilanden [161]. In het humaan genoom wordt van een CpGeiland gesproken indien een regio een CpG-gehalte heeft van 67% of meer, terwijl het
hele genoom gemiddeld ongeveer 41% CpG bevat [163]. Het humaan genoom voldoet
in slechts 1% van sequentie aan deze criteria [164]. Een meer concrete definitie is ’een
DNA-regio van meer dan 200 bp met een CpG-gehalte van meer dan 50%, en waar de
ratio van geobserveerde/verwachte aanwezigheid voor het dinucleotide CpG groter is dan
60%’ [165].
Doordat de DNA-methylatie voornamelijk op C van CpG-dinucleotiden plaatsvindt, zijn
de CpG-eilanden vaak hotspots voor DNA-methylatie. CpG-eilanden komen voornamelijk
voor in de promotorregio en in het eerste exon van genen [109]. Er is aangetoond dat
ongeveer 70% van de promotors geassocieerd zijn met een CpG-eiland. Eilanden waar
hypomethylatie optreedt, worden vaak gelinkt aan housekeeping-genen en hun promotors.
Deze genen zijn vrijwel continu actief. Hypermethylatie van CpG-eilanden die in een
promotorregio liggen gaat vaak gepaard met inactivatie van de genen [154–156, 163].
1.2.3.2
Analyse van DNA-methylatie
Om het methylatiepatroon van het genoom te detecteren, kan geen gebruik gemaakt
worden van de conventionele methodes om DNA-sequenties te analyseren (zoals klonering,
PCR,...). Bij deze technieken gaat het methylatiepatroon namelijk verloren. Er zijn
verschillende technieken mogelijk om het methylatiepatroon op het genoom toch te kunnen
analyseren. Er kan gebruik gemaakt worden van restrictie-enzymes die gevoelig zijn voor
de cytosine-methylatie, methylatie-aanrijkingssequencing methoden (bv MethylCap-seq
[166], MBD-seq [167], MBD-isolated genome sequencing [168]) of methoden die gebaseerd
zijn op een initiële behandeling van het DNA met natriumbisulfiet (zie sectie 1.2.3.2.1)
[169]. De effectieve analyse van het DNA gebeurt aan de hand van detectiemethoden
zoals sequenering, massaspectrometrie, chromatografie,...
1.2.3.2.1
Methoden gebaseerd op bisulfietconversie
Natriumbisulfiet is een chemische stof die cytosine (C) zal deamineren (zie Figuur 7). Als
de stof reageert met DNA, resulteert dit in een omzetting van C naar uracyl (U) [169–172].
Indien het cytosineresidu gemethyleerd was (5mC), zal de deaminatie door natriumbisulfiet twee grootteordes trager doorgaan. 5mC zal dus zo goed als niet worden omgezet
naar U (zie Figuur 7a) [173, 174]. Uracyl vertoont hetzelfde bindingsgedrag als thymine
(T): het zal ook binden met een adenine (A)-residu. Indien het omgezette DNA wordt
geamplificeerd met polymerases, zoals bij PCR, zal een C-G basenpaar worden omgezet
tot een T-A, terwijl een 5mC-G basenpaar niet zal veranderen. Aangezien de guanine
(G)-residu’s niet worden veranderd door de behandeling met natriumbisulfiet, zullen de
twee DNA-strengen niet meer complementair zijn, en zal het DNA worden omgezet in
enkel strengig DNA (ssDNA) [175].
15
(a) Deaminatie van cytosine en 5- (b) Het mapping protocol na bisulfiet
methylcytosine
behandeling
Figuur 7: Het principe van de behandeling van DNA met natriumbisulfiet en het daaropvolgende mappingprotocol [109].
In figuur 7b is het klassieke mappingprotocol te zien dat kan gebruikt worden voor de
analyse van het methylatiepatroon van een DNA-sequentie. In twee identieke sequenties
kan een CpG gemethyleerd zijn (links) of niet gemethyleerd zijn (rechts). Na vergelijking
van de sequenties na de bisulfietbehandeling met de oorspronkelijke sequenties, of door
de geconverteerde sequenties van de sense streng te vergelijken met die van de antisense
streng, kan bepaald worden welke C-residu’s oorspronkelijk wel of niet gemethyleerd waren [109, 175].
De analyse van het bisulfiet geconverteerde DNA kan op verschillende manieren gebeuren:
whole genome sequencing is een heel goede methode waarmee de methylatiestatus over
volledige genomen kan bepaald worden, maar deze is zeer duur [176]. Aangezien er voornamelijk interesse is in de methylatiestatus op de CpG-eilanden, die over het algemeen
ongeveer 1% van het genoom vertegenwoordigen, is Reduced Representation Bisulphite
Sequencing (RRBS) een beter alternatief [177]. Bij deze techniek wordt aan de hand
van restrictie-enzymes slechts 1% van het genoom overgehouden voor analyse via sequencing. Om de kosten nog meer te drukken kan de analyse ook gebeuren met Methylation
Specific PCR (MSP). Bij deze techniek wordt gebruik gemaakt van (q)PCR met twee
verschillende primerparen: een voor het geval cytosine niet was omgezet (5mC) en een
ander voor het geval de cytosines omgezet zijn tot uracyl [178, 179]. Een nadeel van deze
techniek is dat het absoluut niet evident is om geschikte primers te ontwerpen voor een
specifieke regio. Een vierde techniek is targeted bisulphite sequencing. Hierbij worden
primers gemaakt die weinig of geen CpG dinucleotiden bevatten, en die rond een specifieke regio van interesse liggen. Na de bisulfietbehandeling kan aan de hand van deze
primers, onafhankelijk van de methylatiestatus, een fragment geamplificeerd worden met
PCR. Deze amplicons kunnen nadien gesequeneerd worden, waardoor over elke C van dit
fragment info beschikbaar wordt over de methylatiestatus indien kan vergeleken worden
met de oorspronkelijke sequentie [173,180]. Een nadeel van deze techniek is dat er door de
bisulfietbehandeling kleine sequentieverschillen kunnen optreden, waardoor de efficiëntie
van de PCR-amplificatie vrij laag is [181, 182].
16
De bisulfietbehandeling brengt enkele moeilijkheden met zich mee waar rekening mee
moet gehouden worden in de proefopzet en analyse [176]: bisulfiet zorgt er voor dat
het behandelde DNA zal fragmenteren. Daardoor kunnen enkel vrij korte fragmenten
geanalyseerd worden. Fragmenten van meer dan 500 bp worden over het algemeen als te
lang beschouwd.
Ook de reactieomstandigheden zijn cruciaal om correcte resultaten te bekomen. Indien
het DNA te lang wordt blootgesteld, of als de concentratie natriumbisulfiet te hoog is,
zal een groot deel van het DNA kapot gaan. Als de concentratie daarentegen te laag is,
of het DNA wordt te kort blootgesteld aan natriumbisulfiet, zal de conversie niet volledig
zijn, waardoor er vals-positieve resultaten zullen gegenereerd worden.
1.3
Epigenetica en HIV
In het onderzoek van deze masterproef proberen we epigenetische modificaties in verband te brengen met de latentie bij HIV-infecties. Bescherming van cellen tegen endogene parasieten zoals retrovirussen wordt dan ook gezien als een van de functies van
de epigenetische mechanismen in een eukaryoot organisme [16, 19]. Als proviraal DNA
wordt ingebouwd in het gastheergenoom, wordt het onderworpen aan dezelfde mechanismen als dat gastheergenoom. Indien een virale DNA-sequentie herkend wordt, kunnen methyltransferase-enzymen er voor zorgen dat het vreemd DNA wordt geı̈nactiveerd
door DNA-methylatie [183–191]. Op die manier is het de bedoeling dat het vreemd
DNA onschadelijk wordt gemaakt, en in veel gevallen kan het proviraal DNA op deze
manier permanent worden gesilenced. DNA-methylatie vormt dus als het ware een ’oerimmuunsysteem’ dat ervoor zorgt dat cellen de aanwezigheid van het vreemd DNA niet
merken. Het is reeds aangetoond dat de genexpressie van een aantal retrovirussen kan
worden geı̈nactiveerd door hypermethylatie van CpG-dinucleotiden van het 5’-LTR. Dit
heeft virale latentie als gevolg [17, 18, 95–100].
In het genoom van HIV is de 5’-LTR regio de locatie waar belangrijke regulatorische
elementen zoals de promotor en de transcriptie start site voorkomen (zie sectie 1.1.2.2)
[45, 46]. Deze regio reguleert bijgevolg in grote mate de activiteit van de transcriptie van
het virale genoom. Rond de promotor en de transcriptie start site van het HIV-genoom
komen twee CpG-eilanden voor: LTR (long terminal repeat) en NCR (non coding region).
Deze eilanden zijn respectievelijk 100 bp en 188 bp lang en liggen in en rond het 5’-LTR
(zie figuur 8) [108, 109]. Ze liggen in twee regio’s waar geen nucleosomen gevormd worden [192], en die veel bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren hebben [193]. Deze twee
kenmerken worden vaak geassocieerd met bonafide CpG-eilanden [163]. Door de ligging in
een regulatorische regio zijn de CpG-eilanden LTR en NCR zo goed als zeker van belang
bij de virale latentie van HIV-1 [108, 109]. Aangezien CpG-eilanden vaak hotspots zijn
voor DNA-methylatie, speelt deze epigenetische modificatie waarschijnlijk een belangrijke
rol in het mechanisme achter de latentie. Ook rond het Antisense Open Reading Frame
(ASORF) vindt men bij bepaalde subtypes van HIV CpG-eilanden terug: ETR (Envelop,
Tat, Rev) en ENV (Envelop) (zie figuur 8) [109, 194].
17
Het 3’-LTR heeft dezelfde sequentie als het 5’-LTR. Er is dus ook een CpG-eiland gelegen in deze regio (zie figuur 8). Er is reeds aangetoond dat deze regio tijdens latentie
hypomethylatie vertoont [109]. Dit CpG-eiland heeft, net zoals deze rond het ASORF,
waarschijnlijk geen biologische functie [109].
Figuur 8: De bonafide CpG-eilanden zoals beschreven in Chávez et al. [109]. De rode lijnen
onderaan de figuur duiden de regio’s van de CpG-eilanden aan, en zijn gemapt tegenover het
referentiegenoom HXB2 [47]. Binnen het onderzoek van Chávez et al. werd naar verschillende
subtypes binnen de M-groep van HIV-1 gekeken. De percentages die zijn weergegeven is de
conservatie van elk CpG-eiland binnen de subtypes A1, A2, B, C, D, F1, F2, G, H, J, K en AE
van de M-groep van HIV-1 [109].
CpG-suppressie is een fenomeen dat ook in het HIV-genoom voorkomt en toch komen er
in dit korte genoom nog CpG-eilanden voor [195]. De CpG-eilanden van HIV zijn echter wel korter dan 200 bp, de minimumlengte zoals aangegeven in de definitie in sectie
1.2.3.1. Toch worden deze regio’s in HIV beschouwd als echte CpG-eilanden aangezien
hun functie aangetoond is bij de vergelijking tussen productieve en latente infecties [109].
Bij de berekeningen van de CpG-eilanden moet men zich flexibel opstellen, en men moet
rekening houden met het feit dat het genoom van HIV slechts 9.7 kb lang is.
De oorzaak van de virale latentie van HIV-1 in patiënten is nog niet volledig duidelijk.
Het is daarentegen wel zeker dat de latentie wordt gereguleerd door epigenetische mechanismen: de DNA-sequentie van het provirus verandert niet, maar de transcriptie-activiteit
ervan wel. In sectie 1.1.5.2 werd beschreven dat de virale latentie waarschijnlijk wordt
veroorzaakt door een combinatie van verschillende epigenetische mechanismen zoals DNAmethylatie, histonmodificatie, locatie van integratie, aan- of afwezigheid van transcriptionele activators en repressors, en dat DNA-methylatie in de 5’-LTR regio waarschijnlijk
een belangrijke rol speelt [107–109]. Welke rol in het multifactorieel proces van de latentie
precies is weggelegd voor DNA-methylatie, is nog niet volledig opgehelderd. Het zou een
vroeg verschijnsel kunnen zijn in een reeks van epigenetische modificaties waardoor chromatine wordt omgezet tot heterochromatine [109], of het kan net een laat mechanisme
zijn in de reeks van epigenetische modificaties dat de stabiliteit van de latentie in een cel
bepaalt [107].
In cellijnen en bij in vitro latentiemodellen werd wel al duidelijk aangetoond dat inactivatie en latentie van HIV geı̈nduceerd worden door hypermethylatie van de CpG-eilanden
LTR en NCR, en dat hypomethylatie van dezelfde CpG-eilanden leidt tot een actief replicerende HIV-populatie [20, 21, 76, 101–110]. Deze onderzoeken tonen vaak ook aan dat de
18
latentie reversibel is, en dat demethylatie, al dan niet in combinatie met andere factoren,
kan zorgen voor reactivatie van het virus. Deze reactivatie gaat ook gepaard met chromatine remodeling, als gevolg van histonmodificaties [196–199]. Tijdens de reactivatie
vinden wellicht de omgekeerde mechanismen plaats als tijdens de inactivatie.
Er zijn echter nog niet genoeg eenduidige in vivo data om iets te besluiten over het
verband tussen de 5’-LTR CpG-methylatie en de latentie bij HIV-infecties in patiënten
[107, 110–112]. Door de lage HIV-titers in het bloed van de meeste HIV-patiënten, en
doordat de sensitiviteit van PCR-reacties sterk daalt na bisulfietbehandeling, is het zeer
moeilijk om genoeg en betrouwbare in vivo data te genereren [107]. Een extra factor die
de in vivo analyse bemoeilijkt is het feit dat er verschillende types patiënten zijn. De
methylatiepatronen zullen verschillen tussen patiënten die therapie ondergaan met lage
en hoge virustiters in het bloed, en ze zullen nog anders zijn in patiënten zonder therapie,
elite controllers, LTNP,... [112]. Maar ook binnen één patiënt heeft niet elk virus dezelfde
replicatiestatus: een deel van de virussen kan cellen latent infecteren, terwijl een ander
deel van de virussen actief kan repliceren. Daardoor zullen ook binnen één geı̈nfecteerd
individu verschillende methylatiepatronen teruggevonden worden, wat de vergelijking tussen de verschillende types patiënten moeilijker maakt.
Bovendien zullen HIV-virussen tussen de patiënten, maar ook binnen elk geı̈nfecteerd individu, snel muteren. Daardoor zullen niet enkel de methylatiepatronen variëren, maar
ook de genomische sequentie. Het is dus niet evident om de primers te ontwikkelen waarmee het bisulfiet-geconverteerde DNA van alle HIV-1 virussen kan geamplificeerd worden.
Ook het mappen van de gesequeneerde regio’s tegenover het referentiegenoom HXB2 zal
niet zomaar lukken. Dit alles toont dus aan dat er dus nood is aan een betrouwbare test
om de epigenetische status van HIV te bepalen in verschillende types patiënten.
Door de epigenetische modificaties die latentie veroorzaken is het virus niet meer in staat
om te repliceren. Deze modificaties lijken in de eerste plaats een goede bescherming tegen
een HIV-infectie. Aangezien de epigenetische status van het provirus na elke replicatieronde stabiel wordt doorgegeven, zal de activiteit van de virale replicatie niet veranderen
door celdeling [160]. Indien een latent geı̈nfecteerde rustende T-cel daarentegen geactiveerd wordt, zullen er een aantal transcriptiefactoren die in de rustende cel afwezig waren,
toch geproduceerd worden [93]. Daardoor zal, in combinatie met epigenetische veranderingen die het virale DNA toegankelijk maken voor deze factoren, reactivatie van HIV
plaatsvinden. Naast inhibitie van de replicatie, is een ander gevolg van de latentie dat het
provirus ook niet meer vatbaar is voor het immuunsysteem en voor HAART [107]. De
combinatie van de stabiliteit van de latentie en de onzichtbaarheid van het virus voor het
immuunsysteem en medicijnen, zorgt er voor dat het virus niet kan worden geëlimineerd
uit een patiënt [7, 8].
De epigenetische modificaties die de latentie induceren zijn reversibele processen, wat
betekent dat het virus zal gereactiveerd worden indien de medicatie stopgezet wordt. De
patiënt moet daardoor levenslang een vrij grote hoeveelheid medicatie innemen waarvan
hij of zij bovendien geen direct voordeel opmerkt. Anderzijds ondervindt de patiënt wel
talrijke bijwerkingen en is de kostprijs hoog. Het is dus toch gewenst om een methode te
ontwikkelen waarmee het virus definitief uit het lichaam van een patiënt kan geëlimineerd
worden.
19
1.4
Onderzoeksvraag
Het doel van dit onderzoek is om te achterhalen of er een oorzakelijk verband kan gevonden
worden tussen CpG-methylatie en de latentie van HIV-1 in patiënten. Door het gebrek
aan een betrouwbare test om de methylatiestatus van het HIV-genoom in patiënten te bepalen, is het noodzakelijk hier een nieuwe assay voor te ontwikkelen. In deze masterproef
wordt een test ontwikkeld waarbij met next generation deep sequencing het methylatiepatroon op het virale DNA bepaald wordt. Indien er met behulp van deze assay een verband
gevonden wordt, willen we ook te weten komen welke specifieke epimutaties deze latentie
veroorzaken.
Het merendeel van het huidig onderzoek geeft enkel informatie over de CpG-methylatie
in geı̈nfecteerde cellijnen en in vitro modellen, en daarin werd een duidelijk verband aangetoond tussen latentie en methylatie [20, 21, 76, 101–110]. De data over het verband
tussen latentie en CpG-methylatie bij HIV-1 patiënten zijn echter helemaal niet eenduidig [107,110–112]. In deze onderzoeken werd gewerkt met low throughput technieken zoals
klonale expansie en Sanger sequencing, waardoor het niet evident was om op korte tijd
veel data te genereren. Binnen dit onderzoek zullen we trachten via een nieuwe assay met
behulp van high throughput technieken info te vergaren over de latentie in die patiënten.
Er wordt hierbij enkel gefocust op CpG-methylatie in en rond het 5’-LTR als mogelijke
oorzaak van latentie, aangezien de promotor en de transcriptie start site van HIV in deze
regio gelegen zijn [45, 46].
Er wordt een assay geoptimaliseerd waarmee van een grote groep patiënten een methylatieprofiel kan worden opgesteld. Daarbij ligt de focus op de volgende zaken:
• Primers ontwikkelen die geconserveerde regio’s van het virale genoom targetten om
de factor variabiliteit uit te schakelen;
• Informatie verkrijgen over de methylatie van het virale DNA, zowel op de sense als
op de antisense streng;
• Minimalisatie van de fragmentatie van de DNA-strengen tijdens de behandeling met
natriumbisulfiet;
• Sensitiviteit en specificiteit van de PCR-reactie verhogen zodat de test bij lage
concentraties viraal DNA in patiënten ook resultaten oplevert.
De assay moet bruikbaar zijn voor alle types HIV-patiënten. Binnen dit onderzoek wordt
aangetoond dat de assay werkt door hem uit te testen op:
• SupT1-cellijnen, 90-100% geı̈nfecteerd met wild type NL4.3 HIV-1 voor de initiële
testen met hoge concentraties HIV-DNA;
• CD4+ en CD4- T-cellen van een latentiemodel;
• Patiëntenstalen van verschillende types patiënten (geen HAART, korte tijd op HAART
en lange tijd op HAART) om de werkelijke in vivo performantie te testen.
20
2.
Materiaal en methoden
2.1
Primerdesign
2.1.1
Sense primers
Voor het ontwikkelen van sense primers voor PCR op bisulfiet-geconverteerd DNA werd
H2G2 (http://h2g2.ugent.be/biobix.html) gebruikt. Het HIV-referentiegenoom HXB2
(gedownload op 12-08-2014) [47] werd ingeladen in H2G2, en daarop werd eerst visueel
gezocht naar de CpG-eilanden van HIV. Figuur 9 toont de locaties van deze eilanden in
het HIV-genoom, en deze komen overeen met de CpG-eilanden die in de literatuur werden
beschreven (zie sectie 1.3).
Figuur 9: CpG-eilanden in het referentiegenoom HXB2 in H2G2: bovenaan de belangrijke
regio’s in het 5’-LTR; daaronder de locatie van de genen van HIV; onderaan de CpG densiteit
in het HIV-genoom
Vervolgens werden er primers gezocht rond de gevonden CpG-eilanden van het 5’-LTR:
het CpG-eiland Long Terminal Repeat (LTR), de regio van basenpaar 236 tot 415 en het
CpG-eiland Non Coding Region (NCR), de regio van basenpaar 635 tot 851. Ook werd
gezocht naar primerparen die zowel het LTR- als het NCR- CpG-eiland overspannen. Er
moest telkens een van de primers buiten het 5’-LTR (bp 1 - 634) liggen om onderscheid
te kunnen maken tussen het CpG-eiland in het 3’-LTR, dat identiek is aan het 5’-LTR.
De ingebouwde tool voor primerdesign van H2G2 werd gebruikt om bisulfiet sequencingprimers te ontwikkelen rond de gewenste regio’s. Deze tool zoekt naar primers op de
bisulfiet geconverteerde DNA-streng (C → T; CG blijft CG) rond een aangeduide regio.
Er wordt automatisch voor gezorgd dat de primers geen of weinig CpG’s bevatten, want
dat zou de PCR-reactie doen falen. Er zal namelijk een deel van die C’s worden omgezet
door de behandeling van het DNA met natriumbisulfiet, waardoor de primers niet meer
21
22
complementair zouden zijn. Om er echter voor te zorgen dat met de primers enkel geconverteerd DNA zou worden geamplificeerd, moesten de primers wel specifiek zijn voor
regio’s die enkele C’s (niet CpG) bevatten. De gebruikte instellingen voor het design van
primers zijn te zien in tabel 1.
Tabel 1: Instellingen die werden gebruikt voor primerdesign voor bisulfietprimers in H2G2.
Parameter
Primer grootte
Optimale primer smelttemperatuura
Annealingstemperatuura
Primer concentratie
Target concentratie
Na-concentratie
Mg-concentratie
Minimale amplicon lengte
Maximale amplicon lengte
Maximaal aantal identieke basen na elkaar
a
Waarde
18-30 bp
58°C → 64°C
56°C → 61°C
10-6 M
10-16 M
0.03 M
0.001 M
100 bp
800 bp
4 bp
Temperaturen werden getest met intervallen van 0.5°C
Een volgende stap was het controleren of alle gevonden primers uniek waren in het HIV-1
genoom. Daarvoor werd het referentiegenoom HXB2 opgeladen in het programma ’CLC
Sequence Viewer 7’ en in de gevonden forward primers werd elke T omgezet in Y (C of
T), en in de gevonden reverse primers werd elke A omgezet in R (G of A). Vervolgens
werd het referentiegenoom in ’CLC sequence viewer 7’ doorzocht om te controleren of de
omgevormde primersequenties slechts 1 maal voorkwamen. Aangezien de primers in het
5’-LTR ook teruggevonden werden in het 3’-LTR, werd er gezocht naar unieke combinaties
van primers.
Tenslotte werd via de tool ’quick align’ op de site van ’Los Alamos National Laboratory’
(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/QUICK ALIGNv2/QuickAlign.html) gekeken hoe geconserveerd elke regio is waar een primer voor gevonden was. Daarvoor werden
de primersequenties gealigneerd tegenover alle sequenties van het HIV-1 genoom die in
de databank van Los Alamos zijn opgenomen. De focus lag op het subtype B van HIV-1.
Als de primerregio binnen dit subtype 70% of meer geconserveerd was, werd de primer
beschouwd als potentieel bruikbaar. Er werd rekening mee gehouden dat de PCR-reactie
wel nog amplicons kan genereren indien er tot 2 mismatchen per primer aanwezig waren.
Een voorwaarde is dat ze verder dan 5 bp gelegen zijn van het 3’-einde van de primer [200].
Via deze tool werd ook nog eens extra gecontroleerd of er geen andere regio’s in het HIVgenoom voorkomen die vrij gelijkaardig zijn aan de primers, en die dus in een PCR-reactie
ook zouden kunnen worden opgepikt.
2.1.2
Antisense primers
Voor het ontwikkelen van antisense (AS) primers voor PCR op bisulfiet-geconverteerd
DNA werden zowel H2G2 als MethPrimer gebruikt [201]. Er werden ook handmatig primers ontwikkeld. Het HIV-referentiegenoom HXB2 (gedownload op 12-08-2014) [47] werd
omgezet naar de antisense (AS) streng. Daarvoor werden alle C’s omgezet naar G en vice
23
versa, en alle T’s werden omgezet naar A en vice versa. Deze AS streng werd vervolgens
omgedraaid en ingeladen in H2G2. Aangezien CG op de sense streng wordt omgezet tot
GC op de antisense streng, en dat deze streng omgekeerd wordt afgelezen, kennen we
meteen de locaties van CpG-eilanden.
Vervolgens werden er primers gezocht rond de CpG-eilanden van het LTR aan het 3’uiteinde (dat overeenkomt met het 5’-LTR van de sense streng): het CpG-eiland Antisense Long Terminal Repeat (AS-LTR), de regio van basenpaar 9304 tot 9483 en het
CpG-eiland Antisense Non Coding Regions (AS-NCR), de regio van basenpaar 8868 tot
9084. Ook werd gezocht naar primerparen die zowel het AS-LTR- als het AS-NCR- CpGeiland overspannen. Er moest bovendien telkens voor gezorgd worden dat een van de
primers buiten het LTR lag om onderscheid te kunnen maken tussen de identieke CpGeilanden in de 2 LTR’s. De ingebouwde tool voor primerdesign van H2G2 werd gebruikt
om bisulfiet sequencing primers te ontwikkelen rond de gewenste regio’s. Daarvoor werd
dezelfde strategie gebruikt als voor de sense primers zoals beschreven in sectie 2.1.1.
MethPrimer is een online tool die ontwikkeld is voor primerdesign voor methylatie PCR’s
[201]. Er kan een DNA-sequentie worden ingegeven van maximaal 5000 bp en het programma bepaalt de locatie van CpG-eilanden waarrond primers worden ontwikkeld voor
PCR op bisulfiet geconverteerd DNA. Voor het ontwikkelen van antisense primers werden
de laatste 5000 basenparen (4719-9719) en de laatste 1000 basenparen (8719-9719) van
de AS streng ingegeven. De parameters die werden meegegeven voor de voorspelling van
CpG-eilanden zijn te vinden in tabel 2 en de parameters voor het primerdesign zijn te
vinden in tabel 3. Er werd ook meegegeven dat er telkens 9 primerparen moesten gegenereerd worden.
Tabel 2: Instellingen voor het voorspellen van CpG-eilanden in MethPrimer.
Parameter
Window: aantal bp waarin onderstaande parameters geanalyseerd worden
Shift: stapgrootte (aantal bp) waarmee window opschuift
Minimale geobserveerde/verwachte CpG-aanwezigheid
GC%
Waarde
100
1
0.6
40
Tabel 3: Instellingen voor primerdesign voor bisulfietprimers in MethPrimer.
Parameter
Minimum
Optimum
Amplicon lengte
100 bp
350 bp
Primer smelttemperatuur
51°C
57°C
Primer lengte
18 bp
23 bp
Parameter
Minimaal aantal CpG’s in amplicon
Minimaal aantal C’s (niet CpG) in primer
Maximaal aantal opeenvolgende identieke basen (niet T) in primer
Maximaal aantal opeenvolgende T’s in primer
Maximum
600 bp
64°C
28 bp
Waarde
4
4
5
8
24
Ten slotte werden er ook handmatig primers ontwikkeld voor de AS-streng. Eerst werd
deze streng handmatig omgezet naar de bisulfiet geconverteerde sequentie. Daarvoor werden alle C-residu’s omgezet tot T, behalve de C’s van CpG-dinucleotiden. Vervolgens werd
rond de regio’s van interesse de sequentie systematisch overlopen. De gevonden sequenties
(20-30 bp) die in aanmerking kwamen als primer werden ingegeven in het programma OligoCalc [202] om de smelttemperatuur te bepalen. De enige parameter die aangepast werd
was de zoutconcentratie. Deze werd aangepast naar 18mM, de concentratie van de gebruikte PCR-buffer (zie sectie 2.6). Een primer werd als potentieel bruikbaar beschouwd
indien de Nearest Neighbor smelttemperatuur hoger was dan 48°C. De primers mochten
geen of weinig CpG’s bevatten aangezien deze de PCR-reactie zouden doen falen. Dit
komt doordat een deel van die C’s zal worden omgezet door de behandeling van het DNA
met natriumbisulfiet. Om er echter voor te zorgen dat met de primers enkel geconverteerd
DNA zou worden geamplificeerd, moesten de primers wel specifiek zijn voor regio’s die
enkele C’s (niet CpG) bevatten.
Net zoals bij de sense primers, moest ook bij de AS primers gecontroleerd worden of alle
gevonden primers uniek waren in het HIV-genoom. Daarvoor werd de AS-streng van het
referentiegenoom HXB2 ingeladen in het programma ’CLC Sequence Viewer 7’ en in de
gevonden forward primers werd elke A omgezet in R (G of A), en in de gevonden reverse
primers werd elke T omgezet in Y (C of T). Vervolgens werd het AS-referentiegenoom in
’CLC sequence viewer 7’ doorzocht om te controleren of de omgevormde primersequenties
slechts een maal voorkwamen. Ook hier werd er gezocht naar unieke combinaties van
primers.
Tenslotte werd via de tool ’quick align’ op de site van ’Los Alamos National Laboratory’
(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/QUICK ALIGNv2/QuickAlign.html) gekeken hoe geconserveerd elke regio is waar een primer voor gevonden was. Daarvoor werden
de primersequenties gealigneerd tegenover alle sequenties van het HIV-1 genoom die in
de databank van Los Alamos zijn opgenomen. De tool vergelijkt de primers ook met
AS-sequenties in de databank. Ook bij de AS primers lag de focus op het subtype B van
HIV-1. Als er 70% of meer overeenkomst was, werd de primer beschouwd als potentieel
bruikbaar. Er werd rekening mee gehouden dat de PCR-reactie wel nog amplicons kan
genereren indien er tot 2 mismatchen per primer aanwezig waren. Een voorwaarde is dat
ze verder dan 5 bp gelegen zijn van het 3’-einde van de primer [200]. Via deze tool werd
ook nog eens extra gecontroleerd of er geen andere regio’s in het HIV-genoom voorkomen
die vrij gelijkaardig zijn aan de primers, en die dus in een PCR-reactie ook zouden kunnen
worden opgepikt.
De gevonden primerparen (sense en antisense) werden getest aan de hand van een PCRreactie (zie sectie 2.6).
2.2
DNA-materiaal
Indien HIV-negatief gDNA nodig was werden Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC)
gebruikt die verkregen waren via het Rode Kruis. Tijdens het onderzoek werden drie verschillende types HIV-geı̈nfecteerde cellen gebruikt waaruit DNA werd geëxtraheerd. Voor
de ontwikkeling van de PCR-assay werd DNA gebruikt van SupT1 cellijnen die 90-100%
waren geı̈nfecteerd met wild type NL4.3 HIV-1. Deze cellen ondergingen een actieve pri-
25
maire HIV-infectie op het moment dat het DNA geı̈soleerd werd. Er werd ook HIV-DNA
gebruikt dat verkregen was aan de hand van een latentiemodel. Daarvoor werden PBMC’s
van gezonde donoren gebruikt die werden geı̈nfecteerd met het virus NL4.3-IRES-EGFPNEF. Het model werd uitgevoerd zoals eerder beschreven door Bosque et al. [203, 204] en
door Bonczkowski et al. [205]. Tijdens dit model werden uit de PBMC’s eerst naı̈eve CD4+
T-cellen geı̈soleerd. Vervolgens werden deze cellen geactiveerd met behulp van magnetische beads waar antilichamen tegen CD3 en CD28 aan gebonden zijn, in aanwezigheid van
TGF-β, αIL-12 en αIL-4 antilichamen. Op die manier werden Non Polarized (NP)-cellen
gevormd, die bijna hetzelfde fenotype vertonen als Central Memory T-cells (TCM ). Na
zeven dagen werden de cellen geı̈nfecteerd met het virus. Dit virus is gemuteerd waardoor
het geen nieuwe infectieuze partikels kan vormen tijdens deze infectie. Een week na de
infectie werden de CD4+ T-cellen gescheiden van de CD- T-cellen. Deze eerste zijn ofwel
niet geı̈nfecteerd met virussen, ofwel latent, terwijl het tweede type cellen een actieve infectie ondergaat. Bij een actieve HIV-infectie wordt de CD4-expressie namelijk stilgelegd
om superinfectie te voorkomen. Vervolgens werden de cellen gereactiveerd aan de hand
van de magnetische beads met antilichamen tegen CD3 en CD28. Dit zorgt ervoor dat
in de latent geı̈nfecteerde cellen de infectie toch actief wordt en dat de verschillen tussen
deze twee types infectie in dezelfde populatie kan worden bestudeerd. De patiëntenstalen
die tijdens dit onderzoek werden gebruikt zijn stalen uit twee verschillende cohortes. Het
ethisch comité van het Universitair Ziekenhuis Gent had toestemming gegeven voor het
gebruik van de stalen voor wetenschappelijk onderzoek (nummers 2007/057 en 2011/528).
De beschikbare gegevens van deze patiënten zijn te vinden in tabel 4.
2.3
DNA extractie
Het DNA uit de celsuspensies werd via de ’DNeasy® Blood & Tissue Kit’ (69504/69506,
Qiagen) geı̈soleerd volgens het protocol geleverd bij de kit. Enkel de laatste stap van
het protocol werd aangepast tot ’Elueer het DNA door 75 µl Buffer AE toe te voegen
op het centrum van de membraan van de kolom. Incubeer voor tien minuten op 56°C.
Centrifugeer voor één minuut op ≥ 6000 x g’. Tijdens deze extractie werden de cellen
gelyseerd met proteı̈nase K, en werd het DNA in aanwezigheid van chaotrope zouten selectief gebonden aan een silica membraan. De contaminanten en enzyme inhibitoren uit
de cel werden echter wel doorgelaten, waardoor zuiver DNA overbleef op het membraan.
Er werd ook DNA geëxtraheerd aan de hand van cellyse aangezien daar minder verlies
van DNA werd verwacht. De lyse werd uitgevoerd met een zelfgemaakte lysebuffer. De
samenstelling van deze buffer is te vinden in tabel 5. Ter voorbereiding van de lyse
werden de celsuspensies 5 minuten gecentrifugeerd aan 2300 rpm. Aan het gevormde
pellet werd 1 µl buffer toegevoegd per 40.000 cellen (met een minimum van 10 µl indien
er minder dan 400.000 cellen aanwezig waren). Dit mengsel werd vervolgens overnacht
geı̈ncubeerd op 58°C. Achteraf werd er nog een warmteshock uitgevoerd waarbij de cellen
gedurende 10 minuten op 95°C werden gehouden. In tegenstelling tot het DNA dat met
de DNeasy® Blood & Tissue Kit werd geı̈soleerd, bevatten de stalen na lyse naast DNA
ook nog celdebris.
26
05085
05080
05086
05087
05100
08055
96040
05040
08077
09063
10010
04056
03050
02053
03052
01036
Patiënt ID
Neen
Neen
Neen
Neen
Neen
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
HAART
ng DNA/
µl
135
120
10
145
15
280
200
230
350
190
600
150
230
200
260
170
DNAkopijen / µl
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
30
47
133
50
50
165
25
10
1
2
7
viral load
(c / ml plasma)
4.41 log 10
3.72 log 10
4.89 log 10
4.46 log 10
3.77 log 10
8
1
1
3
6
4
1
4
1
13
5
Tabel 4: Lijst van de patiëntenstalen.
kopijen HIV /
106 PBMC’s
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
1240
1295
2630
1424
1673
3263
1861
271
19
80
392
CD4+
T-cellen / µl
934
441
440
838
398
603
688
646
777
932
309
1560
576
745
388
378
HAART duur
(jaren)
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
N/A
15
2
3
2
2
8
8
14
6
7
27
Tabel 5: Samenstelling van de lysebuffer.
Item
Tris HCl, pH 9
Mix Triton + tween20
Proteinase K
ddH2 O
Totaal volume
2.4
Concentratie
0.1 M
0.5%
10 mg/ml
Volume (ml)
1
2
0.4
6.6
10
DNA concentratie
De concentratie van het DNA na isolatie werd bepaald via UV-spectrofotometrie met
behulp van de ’NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer’ (Nanodrop Technologies). Er
werd één µl onverdund DNA aangebracht. Vervolgens werd licht met een golflengte van
230 nm uitgezonden op het staal, en werd de absorbantie berekend na een doorgang van
0.2 mm door het staal. Door vergelijking met een blanco staal (H2 O) kon een DNAconcentratie worden bepaald.
DNA-concentratie werd ook bepaald met ’Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA’ (P7589, Invitrogen™). Daarbij worden fluoroforen enkel fluorescent na binding aan nucleı̈nezuren.
Via de excitatie door licht met een golflengte van 480 nm werd emissie van licht van 520
nm gemeten. Deze analyse gebeurde in een ’BMG FLUOstar Galaxy Microplate Reader’.
De emissie golflengte is specifiek voor een fluorofoor gebonden aan dsDNA, waardoor de
interactie van eiwitten wordt geminimaliseerd. Dit maakt deze techniek geschikt voor
de stalen waar DNA werd geı̈soleerd met de lysebuffer. De intensiteit van de emissie
is gecorreleerd met de concentratie DNA aanwezig in het staal. Aan de hand van een
standaardreeks kan de DNA-concentratie in het staal bepaald worden. De stalen werden
onverdund, 1/10 verdund en 1/100 verdund geanalyseerd. Het protocol geleverd bij de
kit werd gevolgd.
2.5
Bisulfietbehandeling
De bisulfietbehandeling van het geı̈soleerde DNA werd uitgevoerd met de ’EZ DNA
Methylation-Lightning™ Kit’ (D5030, Zymo Research). Er werd 1 µg DNA toegevoegd,
en indien de DNA-concentratie lager was dan 0.05 µg/µl, werd het maximale volume
van 20 µl DNA toegevoegd. Verder werd het protocol van de producent gevolgd. De
elutie van het geconverteerde DNA gebeurde in 30 µl in plaats van in 10 µl. Bij deze
kit wordt het DNA gedenatureerd, en vervolgens geconverteerd met natriumbisulfiet (zie
sectie 1.2.3.2.1). Na die conversie wordt het DNA gebonden aan een silicamembraan,
het bisulfiet wordt verwijderd en het DNA wordt geëlueerd in een buffer waardoor het
geconverteerde DNA meteen bruikbaar is voor Polymerase Chain Reaction (PCR), of kan
worden bewaard op -20°C.
28
2.6
Polymerase Chain Reaction
2.6.1
standaard PCR
Om het bisulfiet-geconverteerde DNA te amplificeren werd een Polymerase Chain Reaction
(PCR) uitgevoerd met het ’FastStart High Fidelity PCR System’ (03553361001, Roche).
Tijdens een eerste fase werden de primercombinaties uit sectie 2.1 getest op het DNA
van de geı̈nfecteerde SupT1 cellen (90-100% infectie met wild type NL4.3 virus). De
samenstelling van de PCR-mix die daarvoor werd gebruikt is te vinden in tabel 6. Het
gebruikte PCR-programma is te vinden in tabel 7.
Tabel 6: PCR-producten voor de standaard PCR-reactie.
Item
Fast Start High Fidelity PCR Buffer
dNTP’s
Primer Mix
Fast Start High Fidelity Enzyme Blend
DNA
Pyrrolidone
H2 O
Totaal volume
Concentratie
10x
10 µM
10 µM
5 U/µl
a
Volume hoger indien er minder dan 8 HIV-kopijen aanwezig zouden zijn.
b
Het extra volume DNA werd gecompenseerd door het H2 O-volume te verminderen.
Volume voor 1 reactie (µl)
5
1
2
0,6
2a
2
37,4b
50
Tabel 7: PCR-programma voor de standaard PCR-reactie.
Cyclus nummer
1
2-6
7-11
12-61
62
Denaturatie
10 min aan 95°C
30 sec aan 95°C
30 sec aan 95°C
30 sec aan 95°C
a
PCR op patiëntenstalen: 45 sec
b
PCR op patiëntenstalen: 60 sec
Annealingsfase
Extensiefase
30 seca aan 60°C
30 seca aan 55°C
30 seca aan 52°C
45 secb aan 72°C
45 secb aan 72°C
45 secb aan 72°C
7 min aan 72°C
Om de gevoeligheid van de PCR-reactie te testen werd er een verdunningsreeks van HIVDNA in humaan gDNA gemaakt. Deze reeks ging van 10.000 kopijen HIV-DNA / 106
PBMC’s tot 50 kopijen HIV-DNA / 106 PBMC’s. Aan de hand van droplet digital Polymerase Chain Reaction (ddPCR) werd een absolute kwantificatie van het HIV-DNA en van
het humaan DNA uitgevoerd (zie sectie 2.6.2). Op basis van het aantal kopijen HIV-DNA
per µl niet-geconverteerd staal werd bepaald hoeveel µl van dat staal nodig was om theoretisch 8 of meer HIV kopijen te omvatten. Er werd minimum 2 µl bisulfiet-geconverteerd
DNA toegevoegd in de PCR-mix, maar indien er een groter volume DNA nodig was om
8 HIV-kopijen te omvatten, werd dat groter volume gebruikt voor PCR. Op die manier
werd de kans dat er minimaal 1 HIV-kopij aanwezig was in de PCR-mix 99.97% volgens
29
Poisson statistiek, en werd de kans klein dat er geen enkel niet-gefragmenteerde kopij
aanwezig was van een regio van interesse. Het extra volume DNA werd in de PCR-mix
gecompenseerd door het volume H2 O even veel te verminderen. In principe kon tot 39.4
µl DNA gebruikt worden. In dat geval zou al het water vervangen zijn door DNA.
De primerparen die de beste gevoeligheid veroorzaakten werden overgehouden voor de
testen op de stalen van het latentiemodel en op de patiëntenstalen. Deze primerparen
zijn te vinden in tabel 8. Ook voor de PCR op patiëntenmateriaal werd de hierboven
beschreven redenering gevolgd om te bepalen hoeveel DNA-input er nodig was voor de
reactie. Het PCR-programma werd licht aangepast: de annealingsfase werd verlengd tot
45 seconden en de extensiefase werd verlengd tot 1 minuut (zie tabel 7).
Tabel 8: Gebruikte primerparen voor de PCR-reactie op patiëntenmateriaal.
Naam
Locatie
sense
streng
Sequentie
Ampliconlengte
LTR2 f
LTR2 r
572→597
887←910
TGTGTGATTTTGGTAATTAGAGATTT
ACTCCCTACTTACCCATACTATAT
338 bp
LTR13 fa
LTR13 ra
228→249
880←909
ATGGATGATTTTGAGAGAGAAG
CTCCCTACTTACCCATACTATATATTTTAA
681 bp
LTR32 fb
LTR32 rb
659→678
804←824
AAGCGAAAGGGAAACCAGAG
TCTCCCCCGCTTAATACTGA
166 bp
AS1 f
AS1 r
899←924
343→372
TGCGAATCGTTTTAGTTTTTTGTTTG
ACTACAAAAAACTTTCCGCTAAAAACTTTC
581 bp
p3-2 f
p3-2 r
790←818
457→486
TCGTTTAATATTGACGTTTTCGTATTTAT
TCTCTCTAATTAAACCAAATCTAAACCTAA
361 bp
f: forward primer; r: reverse primer; a verkregen via Alberto Bosque, Ph.D, University of Utah School of Medicine; b [108]
2.6.2
droplet digital Polymerase Chain Reaction
Via droplet digital Polymerase Chain Reaction (ddPCR) is het mogelijk om een absolute
kwantificatie van een DNA-staal te doen zonder dat er een standaardreeks nodig is [206].
Deze techniek is gebaseerd op een ’water-olie emulsie druppel’ technologie. Het is ook een
goede methode voor zeer gevoelige detectie van sequenties waarvan er weinig voorkomen
in het staal, of voor zeer accurate detectie van variatie van aantal target kopijen. Er werd
gebruik gemaakt van de ’QX100™ Droplet Digital PCR (ddPCR) system’ van Bio-Rad.
Voor ddPCR werd het DNA staal, dat nog niet behandeld is met natriumbisulfiet, gedurende 1 uur behandeld met restrictie-enzymen op kamertemperatuur. Deze reactie zorgt
ervoor dat het DNA fragmenteert zodat het in de later gevormde druppels zal passen. De
restrictie gebeurde met EcoRI-enzymen, aangezien deze enzymen geen knipplaats hebben
in de fragmenten die worden geamplificeerd tijdens de ddPCR. In tabel 9 is te zien welke
reagentia gebruikt werden.
30
Tabel 9: Samenstelling van de restrictie-mix voor het DNA klaar te maken voor ddPCR.
Item
RE Buffer
Geacetyleerd BSA
EcoRI
DNA
Totaal volume
Concentratie
10x
10 µg/µl
10 U/µl
Volume voor 1 reactie (µl)
1
0.1
0,25
8,65
10
Na de restrictie werd het DNA samengebracht met de PCR-mix. De reagentia en workflow zijn vergelijkbaar met real-time PCR assays. Er werden telkens twee verschillende
experimenten uitgevoerd en elk staal werd minstens in duplicaat gemeten. Met het eerste experiment (RU5) werd de totale hoeveelheid HIV-1 DNA bepaald, met het tweede
experiment (RPP30) werd de hoeveelheid van het humane RPP30-gen bepaald. De samenstelling van de ddPCR-mix is te vinden in tabel 10 en de gebruikte primers en fluorescente probes (TaqMan probes die gelabeld zijn met FAM reporter fluoroforen) voor
deze experimenten zijn te vinden in tabel 11.
Tabel 10: Samenstelling van de ddPCR-mix.
Item
ddPCR™ supermix
Forward primer
Reverse primer
Probe
gDNA
H2 O
Totaal volume
Concentratie
2x
10 µM
10 µM
10 µM
50 ng/µl
Leverancier
Roche
IDT DNA
IDT DNA
IDT DNA
Sigma
Volume voor 1 reactie (µl)
10
1
1
0.5
2
5.5
20
Vervolgens werden de stalen van 20 µl gefractioneerd in 20.000 druppels door 50 µl Droplet
Generation Oil for Probes (186-3005, Bio-Rad) toe te voegen in een ’QX100™ droplet generator’. Dit toestel gebruikt de speciaal ontwikkelde reagentia en microfluidica (water-olie
emulsie) om het staal te verdelen in uniforme druppels met een volume van één nanoliter.
Daardoor werd het target DNA en het achtergrond DNA ad random verdeeld in uniforme
druppels (zie figuur 10).
Tijdens de volgende stap werden de gefractioneerde stalen in een 96-well plaat gebracht
voor PCR amplificatie in een thermal cycler. Elke druppel kan gezien worden als een
zeer kleine variant van een PCR-tube waarin een onafhankelijke amplificatie plaatsvindt
(zie figuur 11). Deze enorme fractionering is het sleutelaspect van ddPCR. Het gebruikte
ddPCR-programma is te vinden in tabel 12.
31
Tabel 11: Primers en probes voor ddPCR.
Assay
Totaal
HIV-1
DNA
RPP30
Genomische
regio
RU5
RPP30
Naam
Functie
Sequentie
RU5 F
sense
primer
5’-TTAAGCCTCAA
TAAAGCTTGCC-3’
RU5 R
antisense
primer
5’- GTTCGGGCG
CCACTGCTAGA-3’
RU5
probe
5’-/56FAM/CCAGAGTCA/
ZEN/CACAACAGACG
GGCACA/3IABkFQ/-3’
RP30 F
sense
primer
5’-AGATTTGGA
CCTGCGAGCG-3’
RPP30 R
antisense
primer
RPP30
probe
5’-GAGCGGCTGT
CTCCACAAGT-3’
Lengte
amplicon
130 bp
64 bp
5’-/56FAM/TTCTGACCT/
ZEN/GAAGGCTCTG
CGCG/3IABkFQ/ -3’
Figuur 10: Fractionering van het DNA staal voor ddPCR. DNA fragmenten (target en achtergrond) worden ad random verdeeld in de druppels [207].
32
Figuur 11: Een staal wordt opgedeeld in 20.000 druppels, waarbij in elke druppel PCRamplificatie doorgaat [207].
Tabel 12: ddPCR-programma waarmee in elke druppel PCR-amplificatie kan plaatsvinden.
Cyclus nummer
1
2-41
Denaturatie
5 min aan 95°C
30 sec aan 95°C
Annealingsfase
Extensiefase
30 sec aan 58°C
30 sec aan 58°C
Na de amplificatie van de target DNA-molecules werden de druppels één voor één geanalyseerd in een ’QX100™ Droplet Reader’ (flow cytometer). Daarin werd de fluorescentie
van elke druppel afzonderlijk gemeten (zie figuur 12). Tijdens deze analyse werd aan
de hand van de fluoroforen een digitaal signaal gegenereerd: indien het specifieke PCRproduct werd gevormd in een druppel, werd deze druppel fluorescent gelabeld waardoor
een positief signaal werd gegenereerd (boven treshold, 1). Indien er geen target DNA
aanwezig was, zal er geen PCR-product worden gevormd, en werd er een negatief signaal
gegenereerd (onder treshold, 0). Via Poisson statistiek werd de concentratie van het target
DNA in het oorspronkelijke staal bepaald. Deze analyse gebeurde met de QuantaSoft™
software (Bio-Rad).
Figuur 12: De fluorescentie van elke druppel wordt afzonderlijk geanalyseerd en afhankelijk
van de intensiteit van de piek wordt een positief of een negatief signaal gegenereerd [207].
33
2.7
Analyse van de PCR
Na de PCR werd aan de hand van electroforese gecontroleerd of er amplificatie van het
gewenste product had plaatsgevonden. Er werd gebruik gemaakt van de ’Agilent DNA
1000 Kit’ (5067-1504, Agilent Technologies) en de analyse gebeurde in een ’2100 Bioanalyzer’ (Agilent Technologies). Met dit systeem kan de grootte en de hoeveelheid van het
PCR-product bepaald worden.
Aangezien met een ’Agilent DNA 1000 microfluidic chip’ slechts 12 stalen per keer kunnen worden geanalyseerd, werd dit systeem niet gebruikt indien er veel stalen moesten
bekeken worden. In dat geval werd electroforese uitgevoerd met een ’HT DNA 5K chip’
(CLS760675, Perkin Elmer) in een ’LabChip® GX’ (Perkin Elmer). Met dit systeem kan
van 384 PCR-producten per keer de grootte en de hoeveelheid bepaald worden.
2.8
sequencing
Tijdens de sequencing werd van de gevormde PCR-producten bepaald welke sequentie ze
hadden. Eerst werden de korte fragmenten zoals primer dimeren uit de PCR-producten
verwijderd aan de hand van ’Agencourt AMPure XP - PCR Purification’ (A63881, Beckman Coulter). Daarvoor werden de PCR amplicons aangelengd tot 100 µl, en werd er een
gelijk volume van de magnetische beads toegevoegd. De amplicons binden vervolgens aan
de magnetische beads. De langste fragmenten hebben een grotere affiniteit voor de beads
waardoor deze zullen binden, en de kortere fragmenten blijven achter in het supernatans.
Dat supernatans werd verwijderd, en vervolgens werden de PCR-producten die gebonden
waren aan de beads opgelost in 50 µl elutiebuffer.
In een volgende stap werd aan de hand van PicoGreen (zie sectie 2.4) de concentratie
van de DNA-fragmenten bepaald. Daarna werden de opgezuiverde producten voorbereid voor de sequencing met de ’TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit for
high-throughput studies’ (FC-121-3003, Illumina). Deze kit is zeer geschikt voor de sequenering van CG-rijke regio’s, promotors en repetitieve sequenties. Het protocol dat
bijgeleverd was in de kit werd grotendeels gevolgd, maar er werden enkele aanpassingen
uitgevoerd: de fragmentatie en de daarop volgende opzuivering van het DNA werd niet
uitgevoerd aangezien de amplicons die gevormd waren door de PCR kort genoeg waren
en omdat we info willen over die volledige amplicons. Een andere aanpassing was dat de
adapters 1/10 werden verdund voordat ze aan de stalen werden toegevoegd.
Tijdens deze voorbereiding werden de overhangende uiteinden eerst omgezet tot blunt
ends. Vervolgens werd het staal nogmaals opgezuiverd met magnetische beads (’Agencourt AMPure XP - PCR Purification’ (A63881, Beckman Coulter), zie hierboven). Daarbij kon geopteerd worden om de lange fragmenten uit het staal te verwijderen of om net de
korte fragmenten te verwijderen. Deze regulatie gebeurde door de hoeveelheid toegevoegde
magnetische beads te variëren. De beads binden preferentieel met lange DNA-fragmenten,
dus hoe meer beads er worden toegevoegd, hoe kleiner de fragmenten die in de oplossing
overblijven.
34
De volgende stap hield in om de 3’-uiteinden van de fragmenten te adenyleren (zie figuur
A1). Daarbij werd een adenine gebonden aan het 3’-uiteinde van elk DNA fragment. Op
die manier kon voorkomen worden dat de DNA-fragmenten tijdens de daaropvolgende
ligatie aan elkaar zouden ligeren. Tijdens die ligatiestap werden de adapters, die aan hun
3’-uiteinde een overhangend thymine hebben, gebonden aan de uiteindes van de PCRfragmenten (zie figuur 13). Deze adapters linken aan de DNA-strengen van elk staal een
specifieke combinatie van twee indexen, zodat de verschillende stalen na het sequeneren
van elkaar konden onderscheiden worden. Verder bevatten zij ook een sequencing primerregio en een regio die complementair of identiek is aan de oligonucleotiden die zich op de
flow cell bevinden (zie verder). Na de adapterligatie werd de kwaliteit, hoeveelheid en
de grootte van de fragmenten in de stalen gecontroleerd met electroforese via een ’High
Sensitivity DNA chip’ (5067-4626, Agilent Technologies) op een 2100 Bioanalyzer (Agilent
technologies) en door een qPCR uit te voeren. De stalen werden vervolgens verdund tot
2 nM, waarna er een even groot volume 0.2 nM NaOH wordt toegevoegd om het DNA
enkelstrengig te maken. Ten slotte werd het staal verdund tot 6 pM en was het klaar voor
sequencing.
Figuur 13: Twee adaptersequenties (Rd1 SP en Rd2 SP) worden geligeerd aan het geamplificeerde DNA. Aan deze adapters zijn twee specifieke indexen en oligonucleotiden (P5 en P7)
gebonden die worden gebruikt voor de identificatie en voor binding aan de flow cell respectievelijk [208].
De sequencing gebeurde in een ’MiSeq sequencing system’ (Illumina). In dit toestel gebeurt zowel de amplificatie, sequenering als de data analyse. De sequencing technologie
die in de MiSeq wordt gebruikt, is de Sequencing By Synthesis (SBS) technologie die door
alle platforms van Illumina wordt gebruikt.
Tijdens de eerste fase worden er clusters gevormd door elk enkelstrengig DNA-fragment
isotherm te amplificeren (zie figuren A2 - A6): op de bodem van de laan van de flow cell,
die werd aangebracht in het MiSeq sequencing toestel, zijn er twee types oligonucleotiden
(oligo’s) miljoenen keren gebonden. Aan een van de adapters die tijdens de staalvoorbereiding werden geligeerd aan de DNA-strengen, is een sequentie gebonden die identiek is aan
35
een van de oligo’s op de flow cell, terwijl de sequentie aan de andere adapter complementair is aan de tweede oligo. Deze complementaire sequentie zal ad random hybridiseren
aan de oligo’s op de flow cell (zie figuur A2), waarna door polymerase-enzymen de complementaire streng gevormd werd, waardoor de aangebrachte DNA-streng dubbelstrengig
werd gemaakt. Vervolgens werd het dsDNA gedenatureerd en werd de originele sequentie weggewassen. Nu kan de ssDNA-streng overbuigen, en het uiteinde van deze streng,
dat complementair is aan de tweede oligo die aanwezig was op de flow cell, zal op zijn
beurt hybridiseren. Deze DNA-brug werd door een polymerase omgezet tot een dsDNAbrug (zie figuur A3 en A4), die meteen na de vorming wordt gedenatureerd, waardoor er
twee complementaire ssDNA-strengen ontstaan (zie figuur A5). Dit zijn de forward en
de reverse strengen van de originele inputsequenties. Dit proces werd verschillende keren
herhaald, en gebeurde bij alle gebonden DNA-strengen simultaan, waardoor er miljoenen
clusters werden gevormd op basis van alle fragmenten die in het staal aanwezig waren (zie
figuur A6).
Tijdens de tweede fase, de effectieve sequencing, werden voor de eerste read de reverse
strengen geknipt en weggewassen, waardoor enkel de forward strengen aanwezig bleven op
de flow cell. Om ongewenste priming te voorkomen werden de 3’-uiteinden geblokkeerd.
Voor het sequeneren van de stalen werden de sequencing primers gehybridiseerd aan de
sequencing primerregio, die zich in het begin van de adaptersequentie bevindt, om de
eerste read te genereren. Voor deze read werd er gebruik gemaakt van dNTP-moleculen
die gelinkt zijn aan fluorescent gelabelde reversible terminators. Deze complexen zenden
na excitatie allemaal licht uit met een golflengte die specifiek is voor de dNTP in het complex. Vanaf de sequencing primer werd, aan de hand van die dNTP-reversible terminator
complexen, de DNA sequentie die complementair is aan de reverse streng base per base
opgebouwd. Na elke ligatie van een base, wordt de fluorescente terminator geëxciteerd,
waardoor hij licht uitzendt met zijn specifieke golflengte. Dat licht werd vervolgens in
elke cluster gedetecteerd door een camera, waardoor de sequentie binnen elke cluster base
per base wordt bepaald (zie figuren A7 tot A9). Na de detectie werd de terminator af de
dNTP geknipt, waardoor de binding van het volgende fluorescente complex mogelijk was.
Deze amplificatie gebeurde simultaan binnen elke cluster en gaat door tot als de volledige
streng is geamplificeerd (en dus gesequeneerd). Bovenstaand proces is SBS en gebeurt in
alle clusters samen.
Als de reads afgelopen waren, werd de geproduceerde streng weggewassen, en werd de
eerste index-primer toegevoegd. Deze primer hybridiseert aan de oligo die via de adapter aan de DNA-streng van het staal gebonden was. Net zoals bij de eerste read werd
de sequentie van index 1 bepaald aan de hand van SBS. Ook dit product werd na de
synthese weggewassen, waarna het 3’-uiteinde van de DNA-streng wordt gedeblokkeerd.
Daardoor kan het template overbuigen, waardoor het, net zoals bij de clustervorming,
zal binden met de andere oligo op de flow cel. Nadat de ssDNA-brug was gevormd via
de oligo op de flow cell, werd index 2 op dezelfde manier gesequeneerd als index 1 (de
oligo dient hier als primer). Dit product werd vervolgens weggewassen en aan de hand
van polymerases werd, net zoals tijdens de clustervorming, een dsDNA-brug gevormd die
weer werd gedenatureerd en gelineariseerd. De 3’-uiteindes werden geblokkeerd, waarna
de originele forward strengen werden afgeknipt en weggewassen zodat enkel de reverse
strengen aanwezig bleven op de flow cell. De tweede read werd op exact dezelfde manier
als read 1 gegenereerd, maar met primers die specifiek zijn voor read 2.
36
Doordat de DNA-sequentie base per base wordt gesequeneerd, is deze techniek ideaal voor
sequenties waar dezelfde base vaak na elkaar herhaald is. Aangezien door de bisulfietconversie veel van de C-residu’s worden omgezet tot T, is de kans groot dat er bij de stalen
van dit onderzoek herhaalde sequenties voorkomen.
De data processing van de sequencing werd uitgevoerd door Biobix (http://www.biobix.be).
Via CASAVA (v 1.9, Illumina) werden de data automatisch klaargemaakt voor de processing aan de hand van base calling, demultiplexing, trimming en fastq generation. Daarvoor
werden de standaard instellingen van Illumina gebruikt. Vervolgens werden de sequencing data geanalyseerd met het Bismark package (v 0.14.2) [209]. De volgende wijzigingen
werden doorgevoerd aan de standaardinstellingen van het package: ’-q’ om aan te tonen
dat er gewerkt wordt met fastq formaat, ’–bowtie2’ om Bowtie 2 te gebruiken als onderliggende mapping software, ’-non directional’ werd meegegeven zodat de reads in beide
richtingen moesten worden bekeken, ’-maxins 1000’ werd meegegeven om de maximaal
toegelaten fragmentgrootte te verhogen tot 1000 bp om mapping met langere amplicons
mogelijk te maken.
Nadat de sequenties gemapt waren tegenover het referentiegenoom HXB2, en de methylatiepercentages op de CpG-residu’s bepaald waren, kon differentiële methylatie bepaald
worden. De differentiële methylatie in de sequencingdata werd bepaald aan de hand van
het ’methylKit package’ in R. Daarbij werden verschillende patiëntengroepen telkens op
twee manieren met elkaar vergeleken: bij de eerste vergelijking werden er geen data gefilterd. Voor de tweede methode werden de data met lage coverage (< 50 reads) eruit
gefilterd. Deze filter resulteerde steeds in het verwijderen van alle antisense reads uit
de data. De verdere analyse van de differentiële methylatie gebeurde aan de hand van
de functie ’calculateDiffMeth’. Daarmee wordt differentiële methylatie tussen 2 groepen
bepaald op alle C-residu’s. Als extra optie werd ’slim = FALSE’ meegegeven waardoor de
p-waarde werd gecorrigeerd voor multiple testing aan de hand van de Benjamini-Hochberg
methode.
3.
Resultaten
3.1
SupT1 cellijnen
Tijdens de optimalisatie van de PCR-reactie werden verschillende amplicons van SupT1
cellijnen verzameld. Al het DNA dat daarvoor gebruikt werd, was afkomstig van dezelfde
types cellen die een primaire, actieve infectie (90-100% geı̈nfecteerd) ondergingen met het
NL4.3-virus. Van deze amplicons werden er 24 geselecteerd voor sequenering, en daarbij
werd een grote variatie in primerparen gekozen. Bijgevolg werden er verschillende regio’s
van het HIV-genoom gesequeneerd, en werd er zowel info verkregen van de sense als van
de antisense DNA-strengen. De geteste primerparen overlappen enkel regio’s in de CpGeilanden LTR en NCR, en werden getest op verschillende batchen DNA. Een lijst met
de gebruikte primers is te vinden in tabel A1. De primerparen LTR2 en LTR13 werden
respectievelijk 3 en 2 keer getest op de verschillende batchen DNA, alle andere primerparen werden slechts één keer getest. Van de 24 PCR-producten die gesequeneerd werden
gaven er slechts 17 een output. De coverage voor deze testen is variabel en gaat van 6
reads voor sommige stalen tot meer dan 11.000 reads voor andere stalen. Een overzicht
van de coverage per C-residu van deze 17 stalen is te zien in tabel A2. Er werden uit de
data enkele resultaten geëxcludeerd aangezien ze buiten de regio van de primers werden
gemapt enerzijds, of omdat het aantal reads uitzonderlijk laag was in vergelijking met de
rest van hetzelfde staal anderzijds.
De methylatiegraad van de gesequeneerde CpG-eilanden op het HIV-DNA in deze 17
stalen is weergegeven in figuur 14. In figuur 14a is voor elke test per C-residu op het referentiegenoom HXB2 te zien hoeveel procent methylatie er optreedt. Figuur 14b toont een
heatmap waarop ook het percentage methylatie te zien is per C-residu op elk staal. Deze
figuren geven enkel info over de locaties waar CpG’s voorkomen op het referentiegenoom
HXB2. Aangezien methylatie op andere cytosines (CpA, CpT en CpC) zelden voorkomt,
worden deze regio’s buiten beschouwing gelaten. Over het algemeen werd in deze cellijnen
lage CpG-methylatie (<5%) teruggevonden ter hoogte van de CpG-eilanden LTR en NCR
op de virale genomen. Echter, bij 7 van de 17 stalen waren er toch één tot drie C’s waar
de methylatiegraad tussen 5 en 33% lag en bij de stalen die met LTR14, LTR32 en AS9
werden geamplificeerd, werd hoge methylatie teruggevonden van respectievelijk 0 - 80%,
17.02 - 99.96% en 13.68 - 100%. Tussen de batchen DNA werd er dus een kleine variatie in
de methylatietoestand waargenomen, ondanks het feit dat al het DNA op dezelfde manier
verkregen was.
37
38
(a) De methylatiegraad van de C-residu’s in de SupT1 cellijnen die een
primaire, actieve infectie (90-100%) met het NL4.3-virus ondergingen.
(b) Heatmap van de methylatie in de SupT1 cellijnen die een primaire,
actieve infectie met het NL4.3-virus ondergingen. Voor de witte vakjes
waren er geen data beschikbaar.
Figuur 14: De data van de methylatie op de virale genomen van de testen op de SupT1cellijnen.
39
3.2
3.2.1
Latentie model
Coverage
Van de stalen van het latentiemodel was het door omstandigheden niet mogelijk om van
de gereactiveerde CD4- T-cellen DNA te verkrijgen. Het was tevens niet mogelijk om
DNA te verkrijgen van de CD4+ T-cellen voor reactivatie. Van de gereactiveerde CD4+
T-cellen (Staal 1-6) en de niet-gereactiveerde CD4- T-cellen (Staal 7-12) was er wel DNA
beschikbaar. In beide groepen stalen waren er zowel T-Helper 1 cellen (TH1 ), T-Helper 2
cellen (TH2 ) als TCM aanwezig.
Alle stalen werden geamplificeerd met primerparen LTR32 en AS2-3, en vervolgens gesequeneerd. In alle 24 PCR-reacties werd DNA van de gewenste lengte geamplificeerd. De
coverage na sequencing per C-residu in CpG-dinucleotiden van deze 12 stalen is te zien
in tabel A3. Er is duidelijk te zien dat de coverage van de antisense strengen (6-94 reads)
een pak lager is dan de coverage van de sense strengen (1220-15843 reads). Bij verdere
analyse van de stalen uit het latentiemodel werd voornamelijk gefocust op de meest betrouwbare resultaten (sense strengen).
3.2.2
Methylatie
In figuur 15 is een heatmap te zien met het percentage methylatie van elk C-residu per
staal op de sense streng van het HIV-DNA. Figuur A10 geeft ter volledigheid ook een heatmap weer waarop ook de C-residu’s zijn weergegeven van de antisense strengen. Tabel
13 toont het gewogen gemiddelde van de methylatiegraad van alle stalen van het latentiemodel per C-residu op de sense streng. Hierop is duidelijk te zien dat de methylatie
een stuk hoger is dan bij de SupT1 cellijnen. Enkel op 718 C is lage methylatie te zien.
Verder wordt op de C-residu’s die centraal zijn gelegen in het CpG-eiland NCR matige
methylatie teruggevonden (30-60%), en op de C-residu’s aan het begin en aan het eind
van het CpG-eiland wordt hoge methylatie teruggevonden (60-100%).
Er werd een differentiële methylatie-analyse uitgevoerd tussen de gesequeneerde CpGresidu’s van de gereactiveerde CD4+ T-cellen enerzijds en de niet-gereactiveerde CD4T-cellen anderzijds. In tabel 14 zijn de resultaten weergegeven van deze analyse waar
enkel gebruik gemaakt wordt van de sequencing data op de sense streng van het DNA.
Op de sense streng is te zien dat er over het algemeen minder CpG-methylatie voorkomt
op het DNA in de niet gereactiveerde CD4- T-cellen. Ondanks de p-waarde correctie aan
de hand van Benjamini Hochberg, die voor zulke korte fragmenten wellicht een overconservatieve correctie zal doorvoeren, werden toch nog significante verschillen gezien: op 12
van de 15 geanalyseerde C-residu’s is er significante differentiële methylatie (q<0.05), en
op 11 van de 12 C’s is er minder methylatie in deze cellen. Het verschil is echter wel klein:
op de afzonderlijke C-residu’s was er 0.1-2.5% verschil tussen de twee groepen. Enkel op
816
C werd een klein beetje meer methylatie (0.021%) teruggevonden op het DNA van de
CD4- T-cellen. In tabel A4 wordt voor de volledigheid het resultaat van dezelfde analyse
getoond, maar dan zonder dat eerst de minst betrouwbare data (data van de antisense
strengen) eruit werden gefilterd. Op geen enkel C-residu van de antisense streng werd
significante differentiële methylatie teruggevonden.
40
Figuur 15: Heatmap van de methylatie in de cellen van het latentiemodel; sense streng. Voor
elke locatie van een CpG in HXB2 binnen de gesequeneerde regio is het methylatiepercentage
weergegeven. Voor het witte vakje waren er geen data beschikbaar. Links van de zwarte lijn
zijn de gereactiveerde CD4+ T-cellen; rechts van de zwarte lijn zijn de niet-gereactiveerde CD4T-cellen.
Tabel 13: Gewogen gemiddelde van de methylatie per basenpaar van alle stalen van het latentie
model (LM), de patiënten die op het moment van staalname geen therapie ondergaan (Naı̈ef)
en de patiënten die therapie ondergaan op moment van staalname (HAART).
Locatie
HXB2
661
687
690
699
712
714
718
728
735
738
751
770
797
803
816
Gewogen gemiddelde (% methylatie)
LM
Naı̈ef
HAART
99.957
99.929
98.939
88.424
97.086
95.588
59.478
83.895
80.770
59.503
83.793
80.542
58.983
83.296
79.791
29.325
13.434
15.447
0.191
0.263
0.287
29.277
13.442
15.642
29.297
13.411
15.742
29.378
14.525
15.755
87.884
96.254
95.540
60.105
82.381
79.533
99.804
99.882
98.815
99.881
99.907
98.836
99.989
99.977
99.011
41
Tabel 14: Differentiële methylatie per C-residu tussen de gereactiveerde CD4+ T-cellen en de
niet-gereactiveerde CD4- T-cellen; sense streng. De vetgedrukte locaties vertonen significante
verschillen op het 5% significantieniveau.
Locatie
HXB2
661
687
690
699
712
714
718
728
735
738
751
770
797
803
816
3.3
Patiënten
3.3.1
Coverage
p
q
4.02E-01
0.00E+00
5.31E-03
1.06E-02
3.49E-04
4.28E-11
1.12E-04
1.04E-11
1.13E-12
2.59E-13
0.00E+00
6.58E-01
1.05E-01
3.11E-05
1.80E-03
4.31E-01
0.00E+00
7.25E-03
1.33E-02
5.82E-04
1.07E-10
2.10E-04
3.11E-11
4.25E-12
1.30E-12
0.00E+00
6.58E-01
1.22E-01
6.66E-05
2.70E-03
Differentiële
methylatie (%)
0.011
-2.468
-0.816
-0.748
-1.049
-1.790
-0.098
-1.845
-1.930
-1.987
-1.849
-0.129
0.043
-0.087
0.021
De patiëntenstalen werden voor de sequencing met 5 verschillende primerparen geamplificeerd, maar in feite waren er slechts 2 van deze primerparen effectief: LTR32 gaf voor
alle patiëntenstalen een amplicon, terwijl AS2-3 voor 8 van de 16 een amplicon gaf. In 2
van de 16 stalen werd ook een amplicon verkregen met het primerpaar LTR2. Er waren
5 stalen van patiënten die op het moment van staalname niet behandeld werden tegen
de HIV-infectie, en 11 stalen van patiënten die wel therapie volgden bij staalname. De
coverage voor de patiëntenstalen is vergelijkbaar met die van de stalen van het latentiemodel. De coverage per C-residu van deze 16 stalen is te zien in tabel A5. Op de antisense
strengen is de coverage telkens zeer laag (5-42 reads) terwijl de coverage van de sense
strengen overal hoog is (1209-17448 reads). Ook hier werd, net zoals bij de data van het
latentiemodel, voor de verdere analyse van de stalen voornamelijk gefocust op de meest
betrouwbare resultaten (sense strengen).
42
3.3.2
Methylatie
Figuur 16 toont een heatmap met het percentage CpG-methylatie per patiëntenstaal.
Deze figuur geeft enkel info over de C-residu’s op de sense strengen van het CpG-eiland
NCR in het HIV-DNA. Figuur A11 toont voor de volledigheid ook een heatmap van de
CpG-methylatie van alle beschikbare data (sense en antisense strengen). In tabel 13 is
het gewogen gemiddelde van de methylatiegraad van alle patiëntenstalen weergegeven per
C-residu op de sense streng. Hier is duidelijk op te zien dat de methylatie een stuk hoger
is dan bij de SupT1 cellijnen, maar eerder vergelijkbaar is met de methylatie op de stalen
van het latentiemodel. Aan de uiterste C-residu’s 661 C, 797 C, 803 C en 816 C van het CpGeiland NCR is er vergelijkbare methylatie te zien bij de patiëntenstalen als bij de stalen
van het latentiemodel. De centrale C-residu’s 714 C, 728 C, 735 C en 738 C vertonen minder
methylatie dan de stalen van het latentiemodel, en de C-residu’s ertussen vertonen hogere
methylatie in de patiëntenstalen. Net zoals bij de stalen van het latentiemodel wordt op
het DNA in de patiëntencellen op 718 C een lage methylatie gezien. De centrale C-residu’s
vertonen matige methylatie (13-16%), en op de C-residu’s aan het begin en aan het eind
van het CpG-eiland NCR wordt hoge methylatie teruggevonden (80-100%).
Figuur 16: Heatmap van de methylatie in de patiëntenstalen; sense streng. Voor elke locatie
van een CpG in HXB2 binnen de gesequeneerde regio is het methylatiepercentage weergegeven.
Links van de zwarte lijn zijn de patiënten die op het moment van de staalname geen therapie
ondergingen; de patiënten die op het moment van de staalname wel therapie kregen staan rechts
van de zwarte lijn.
Om een idee te krijgen of de mate van de activiteit van het virus een verband toont met
de methylatiestatus van de CpG-eilanden werd het methylatiepatroon van de patiënten
die op het moment van staalname geen therapie ondergingen vergeleken met dat van de
patiënten op therapie tijdens staalname. Tabel 15 toont de differentiële methylatie die
bepaald is op basis van de meest betrouwbare data (sense strengen). Voor de volledigheid
43
werd deze analyse ook uitgevoerd op alle data, en de resultaten daarvan zijn te vinden in
tabel A6. Op de data van de antisense strengen kon op het 5% significantieniveau niets
besloten worden. Bij de sense strengen daarentegen was er, ondanks de p-waarde correctie
die op deze korte fragmenten waarschijnlijk overconservatief zal zijn, op 14 van de 15 geanalyseerde C-residu’s een significant verschil te zien. Op 714 C, 728 C, 735 C en 738 C werd als
gevolg van de therapie een verhoging van methylatie van 1.23 tot 2.33% teruggevonden.
Behalve op 718 C, waarover niets significant kan besloten worden, zorgt de therapie ervoor
dat op alle andere geanalyseerde C-residu’s een verlaging van de methylatie van 0.72 tot
3.51% plaatsvindt.
Op de methylatiedata van de patiënten werd ook een clusteranalyse en een Principle Component Analysis (PCA) uitgevoerd (zie figuur 17). Bij de clusteranalyse is te zien dat 3
van de 5 patiënten die geen therapie ondergingen op het moment van staalname samen
clusteren. Ook bij de PCA komen 4 van de 5 patiënten zonder therapie in dezelfde regio
voor. Dit wil zeggen dat de methylatie bij de patiënten zonder HAART toch enigszins
een bepaald patroon volgt dat verschillend is van dat van de patiënten op therapie. De
patiënten die onder therapie staan vertonen veel meer verschillen in hun methylatiepatronen. Zowel bij de clusteranalyse als bij de PCA zijn ze meer variabel.
Er werd ook nagegaan of de duur dat een patiënt HAART ondergaat een invloed heeft op
het methylatiepatroon van de virale genomen. Van de elf patiënten die behandeld werden
tegen HIV op het moment van staalname, zijn er tien waarvan geweten is hoe lang ze al
medicatie namen op het moment van de staalname. Van deze tien waren er vier patiënten
die 3 jaar of minder medicatie namen en zes die al langer behandeld werden. Deze grens
werd gebruikt om de groep in twee te splitsen zodat de differentiële methylatie tussen
die twee groepen kon bepaald worden. In tabel 16 zijn de resultaten van deze analyse te
zien indien enkel rekening wordt gehouden met de data van de sense strengen. Voor de
volledigheid werd de analyse ook uitgevoerd op alle data, maar deze analyse leverde in
de antisense strengen geen extra significante verschillen op (zie tabel A7). Op de sense
streng daarentegen was er op 4 locaties differentiële methylatie te zien, maar de verschillen tussen de 2 groepen waren eerder klein (<1% verschil). Twee van de C-residu’s waar
verschil werd gedetecteerd (718 C en 770 C) vertoonden minder methylatie (0.42-0.74%) bij
de patiënten die langer waren blootgesteld aan HAART. De overige twee C’s (751 C en
797
C) vertoonden iets meer methylatie (0.43-0.60%) bij langdurige inname van HAART.
44
Tabel 15: Differentiële methylatie tussen patiënten die geen therapie ondergaan op het moment
van staalname ten opzichte van patiënten op therapie tijdens staalname; sense streng. De
vetgedrukte locaties vertonen significante verschillen op het 5% significantieniveau.
Locatie
HXB2
661
687
690
699
712
714
718
728
735
738
751
770
797
803
816
p
q
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
4.65E-01
0.00E+00
0.00E+00
1.02E-10
1.06E-11
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
4.65E-01
0.00E+00
0.00E+00
1.09E-10
1.22E-11
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
0.00E+00
Differentiële
methylatie (%)
-0.992
-1.501
-3.128
-3.252
-3.508
2.013
0.020
2.199
2.328
1.226
-0.715
-2.849
-1.067
-1.073
-0.964
(a) Cluster analyse van de CpG-methylatie van (b) PCA van de CpG-methylatie van HIV in
HIV in patiëntenstalen.
patiëntenstalen.
Figuur 17: Cluster analyse en PCA van de methylatiestatus in patiëntenstalen. De rode
patiënten ondergaan geen HAART tijdens staalname, de blauwe wel.
45
Tabel 16: Differentiële methylatie tussen patiënten die minder dan drie jaar therapie ondergaan ten opzichte van patiënten die meer dan drie jaar therapie ondergaan; sense streng. De
vetgedrukte locaties vertonen significante verschillen op het 5% significantieniveau.
Locatie
HXB2
661
687
690
699
712
714
718
728
735
738
751
770
797
803
816
p
q
1.60E-01
1.57E-01
5.48E-01
6.04E-02
1.06E-01
2.41E-02
0.00E+00
6.12E-01
9.37E-01
3.34E-01
2.57E-03
1.01E-02
7.02E-14
4.07E-01
3.18E-02
2.40E-01
2.40E-01
6.32E-01
1.29E-01
1.99E-01
7.24E-02
0.00E+00
6.55E-01
9.37E-01
4.56E-01
1.28E-02
3.79E-02
5.26E-13
5.09E-01
7.95E-02
Differentiële
methylatie (%)
0.108
-0.202
0.169
0.530
-0.463
-0.586
-0.416
0.133
0.021
0.253
0.430
-0.739
0.605
-0.066
0.160
46
4.
Discussie
4.1
Optimalisatie van de assay
Het onderzoek naar het oorzakelijk verband tussen CpG-methylatie in het HIV-1 genoom
en de latentie van het virus bracht enkele moeilijkheden met zich mee. Zo zorgt de hoge
mutatiesnelheid van het retrovirus voor een enorme variabiliteit, zowel tussen verschillende patiënten als binnen elke patiënt. Dit maakt het vinden van geschikte primers
moeilijk. Bovendien zorgt de therapie die de meeste patiënten ondergaan ervoor dat er in
de stalen een zeer lage concentratie is aan viraal DNA in een grote pool van genomisch
DNA (gDNA). Daardoor moest de PCR-reactie op verschillende vlakken geoptimaliseerd
worden. De twee bovenstaande moeilijkheden zorgen er bovendien voor dat de ontwikkeling van een multiplex assay gewenst was waarbij zowel naar de sense als naar de antisense
streng kan worden gekeken. Op die manier krijgen we evenveel info als indien we het staal
zouden opsplitsen, maar is het mogelijk optimaal gebruik te maken van het weinige beschikbare DNA. Ten slotte brengt de structuur van het virale genoom nog een moeilijkheid
met zich mee: het 5’-LTR is identiek aan het 3’-LTR. Daardoor was het noodzakelijk om
lange fragmenten te amplificeren indien we info wilden over alle CpG-eilanden waarin we
geı̈nteresseerd zijn. Door de fragmentatie die de bisulfietbehandeling met zich meebrengt
is dit niet evident.
De variabiliteit van het virale genoom zorgde ervoor dat het vinden van geschikte primers
voor PCR niet evident was. Veel van de gevonden primerparen op basis van het referentiegenoom HXB2 werden zelfs niet getest aangezien de regio’s waar ze gelegen waren
minder dan 70% geconserveerd waren binnen het subtype B van HIV-1. Als vuistregel
werd aangenomen dat een regio geconserveerd was als er maximaal twee mismatchen zijn
in de sequentie die de primer target, en dat deze mismatchen verder dan vijf basenparen
van het 3’ uiteinde van de primer voorkomen [200]. Bovendien waren de regio’s van de
gebruikte primers nooit meer dan 90% geconserveerd binnen het subtype B en werd er
enkel gefocust op dat ene subtype. Het zal dus zeker de vraag zijn of de gebruikte primers
wel bruikbaar zullen zijn voor de methylatieprofilering bij alle HIV-patiënten. Door de
enorme mutatiesnelheid van het virus zal er ook een grote virale variabiliteit ontstaan
binnen elke HIV-patiënt. Het is dus mogelijk dat aan de hand van de huidige test slechts
een deel van de virale genotypes binnen een patiënt zullen geamplificeerd worden. We
moeten ons dus niet enkel afvragen of de test wel voor alle patiënten bruikbaar zal zijn,
maar ook of de resultaten wel relevant zullen zijn voor de volledige viruspopulatie binnen
één patiënt. De enige mogelijke oplossing voor de problemen rond de variabiliteit is om
veel verschillende primerparen rond dezelfde CpG-eilanden te ontwikkelen en uit te testen. Op die manier kunnen meer virale genomen geamplificeerd en gesequeneerd worden
47
48
en zullen de resultaten representatief worden voor de volledige HIV-1 populatie. Bovendien zal de PCR-reactie voor elk van de primerparen moeten geoptimaliseerd worden: het
temperatuurprogramma en de mastermix kunnen ervoor zorgen dat de amplificatie van
een specifieke regio wel of niet doorgaat.
De therapie die de meeste HIV-patiënten ondergaan (HAART) zal de replicatie van het
virus stopzetten, waardoor de hoeveelheid HIV-geı̈nfecteerde cellen zeer laag gehouden
wordt. Dit zorgt ervoor dat er na DNA-isolatie uit de CD4+ T-cellen van patiënten zeer
weinig viraal DNA aanwezig zal zijn in een heel grote pool van gDNA. Bijgevolg is voor
de detectie van viraal DNA een zeer gevoelige en specifieke test nodig. De optimalisatie
van de PCR-reactie heeft ervoor gezorgd dat viraal DNA in een grote hoeveelheid achtergrond DNA toch te detecteren was: zelfs een staal waar slechts 19 kopijen HIV-DNA
per 106 PBMC’s aanwezig waren leverde na bisulfietbehandeling amplicons. De aanpassingen die voor die optimalisatie doorgevoerd werden resulteerden in het verhogen van de
DNA-input zodat er, zonder de fragmentatie door de bisulfietbehandeling in rekening te
brengen, theoretisch minimaal acht HIV-kopijen aanwezig zouden zijn per reactie. Ook
werd het aantal PCR-cycli verhoogd van 30 tot 50 en werd het temperatuurprogramma
aangepast. Tijdens dit onderzoek werden slechts twee PCR-mixen met elkaar vergeleken:
een met en een zonder pyrrolidone. Al snel bleek dat de pyrrolidone een positieve invloed
had op de efficiëntie van de PCR, en werd er enkel verder gewerkt met de tweede mix. Om
een optimale gevoeligheid te bereiken van de PCR-reactie voor alle primerparen zou de
mastermix ook nog verder kunnen geoptimaliseerd worden en zouden er meer alternatieve
temperatuurprogramma’s kunnen worden uitgetest.
De variabiliteit van HIV en de lage concentratie van viraal DNA in bloedstalen van een
patiënt brengen nog een ander probleem met zich mee. Door de hoge mutatiesnelheid van
het virus zal een zeer grote variabiliteit ontstaan (zie sectie 1.1.6). Bijgevolg zal, indien
er na sequenering een T wordt gezien, niet met zekerheid gezegd kunnen worden of er in
het oorspronkelijke virale genoom een T, of een niet-gemethyleerde C (na bisulfietbehandeling omgezet tot T) aanwezig was. Het resultaat van de sequencing werd echter wel
gemapt tegenover het referentiegenoom HXB2, dus er was telkens wel een aanwijzing of
de oorspronkelijke sequentie een T of een C bevatte.
Doordat natriumbisulfiet C wel verandert, maar G niet aantast, zijn na de behandeling de
twee DNA-strengen niet meer complementair. Daardoor zullen de primers die ontwikkeld
worden voor de amplificatie van geconverteerd DNA slechts één van de twee strengen
amplificeren tijdens een PCR (zie figuur 18) [175]. Bij het design van de primers werd
er namelijk voor gezorgd dat enkel geconverteerd DNA zou worden opgepikt. Daarvoor
werden de primers telkens gematcht aan een regio waar er enkele cytosines (niet-CpG) liggen. Aangezien deze C’s zelden methyleren, kan ervan worden uitgegaan dat ze allemaal
omgezet worden naar U tijdens de behandeling met bisulfiet [109]. In de sequentie van
de forward primers op de sense streng werden op deze locaties dus T-residu’s ingebouwd,
en in de sequentie van de reverse primer A-residu’s. Bijgevolg zijn de primers enkel compatibel met de sense streng, maar niet met de antisense streng. Op die manier konden er
primerparen worden ontwikkeld die specifiek waren of voor de sense, of voor de antisense
streng.
49
Figuur 18: In tegenstelling tot PCR op DNA dat niet behandeld is met natriumbisulfiet kunnen
beide DNA-strengen hier niet samen worden geamplificeerd. In de oorspronkelijk complementaire DNA-strengen ’a’ en ’b’ worden de niet gemethyleerde C-residu’s omgezet tot U (de vet
gedrukte basen). Na de bisulfietconversie zijn de twee DNA-strengen niet meer complementair,
en bijgevolg moeten ze afzonderlijk worden geamplificeerd [175].
Door het opsplitsen van de stalen zou het vergelijken van de sequentie van de sense streng
met de sequentie van de niet-geconverteerde streng, of met die van de antisense streng
uitsluitsel kunnen geven over de herkomst van een T op de geconverteerde sequentie. In
het geval dat we de antisense sequentie vergelijken met de sense sequentie, zou zelfs een
stuk meer informatie over de methylatie kunnen worden bekomen aangezien dan de methylatie op beide strengen in kaart zou kunnen gebracht worden. Bovendien zou er op die
manier een controle zijn op de efficiëntie van de bisulfietconversie die werd uitgevoerd:
van de CpT-, CpC- en CpA- dinucleotiden zou meer dan 99% moeten worden omgezet,
aangezien deze C’s zelden gemethyleerd worden [109]. De efficiëntie van de conversie kan
exact bepaald worden indien de 2 strengen met elkaar zouden worden vergeleken.
Omdat er slechts weinig HIV-DNA aanwezig is in het bloed van de patiënten, en aangezien
er een vrij grote DNA-input nodig is om na de conversie met bisulfiet een nog voldoende
grote hoeveelheid intact DNA over te houden, is het opsplitsen van de DNA-stalen echter
niet gewenst. Dit zou namelijk betekenen dat we in enkele gevallen een tekort aan viraal
DNA zouden kunnen krijgen. Indien de stalen toch worden opgesplitst, is het bovendien
door de hoge mutatiesnelheid van HIV mogelijk dat de verschillende delen van het staal
ook verschillende varianten van het virus zullen bevatten.
Er werd bijgevolg gezocht naar een multiplex assay waarbij zowel de sense streng als
de antisense streng na bisulfietconversie samen geamplificeerd worden. Indien deze twee
primerparen dezelfde regio overspannen, kan zonder het staal op te splitsen toch ontdekt worden van waar elk thymineresidu afkomstig was. Indien er na mapping een T-G
mismatch gevonden wordt tussen de twee strengen, is de gevonden T een C op de oorspronkelijke streng. Als er een T-A match wordt gevonden, is de gevonden T ook op de
oorspronkelijke streng een T. Om een multiplex assay te ontwikkelen moeten er primers
50
gevonden worden waarvan zowel de annealingstemperatuur als de efficiëntie van amplificatie ongeveer gelijk zijn. Aangezien deze assay voor dit onderzoek nog niet op punt staat,
werden hier de sense streng en de antisense streng toch nog afzonderlijk geamplificeerd.
Op die manier moet het staal wel worden opgesplitst, maar verkrijgen we meer informatie
dan als we enkel de sense streng zouden amplificeren. Met de huidige primers waren de
eerste testen voor de multiplex assay wel al vrij hoopvol: bij 2 van de 4 multiplex PCRreacties die werden uitgetest waren er voor zowel de sense als de antisense primerparen
amplicons gevormd (deze resultaten zijn niet weergegeven).
Een volgende moeilijkheid is dat het 5’-LTR van HIV identiek is aan het 3’-LTR. Doordat
het virus ad random wordt geı̈ntegreerd in het gastheer-DNA is het niet mogelijk om
een van de primers buiten het virale genoom te leggen. Om toch onderscheid te kunnen maken tussen het 5’-LTR waarin we geı̈nteresseerd zijn binnen dit onderzoek en het
3’-LTR waarin zich geen interessante regio’s bevinden, moet telkens een van de primers
buiten het LTR liggen. Door de behandeling met bisulfiet zal het DNA fragmenteren tot
fragmenten die over het algemeen kleiner zijn dan 500 basenparen. Het 5’-LTR loopt van
basenpaar 1 tot en met 634, en aangezien we interesse hebben in het CpG-eiland LTR,
dat gelegen is tussen basenpaar 236 en 415, moet de forward primer gezocht worden in de
regio tussen basenpaar 1 en basenpaar 236 van het referentiegenoom HXB2. De reverse
primer moet gelegen zijn na basenpaar 634, waardoor de minimale lengte van het gewenste
amplicon 398 bp bedraagt. Dit is al vrij lang voor fragmenten na bisulfietbehandeling.
Bovendien is er ook een CpG-eiland gelegen van basenpaar 635 tot 851. Er zijn best geen
CpG-dinucleotiden aanwezig in de primers, waardoor het niet aangeraden is om binnen
een CpG-eiland te zoeken naar primers. Indien we dus de beide CpG-eilanden willen
overbruggen, moeten de primers een regio van meer dan 615 bp overspannen.
Zo een lengte wordt normaal als te lang beschouwd na bisulfietbehandeling. De kit die
werd gebruikt voor de bisulfietbehandeling (EZ Methylation Lightning™ Kit, Zymo Research) werd gekozen omdat bij deze kit het natriumbisulfiet slechts gedurende een korte
tijd (één uur) moet inwerken op het DNA. Volgens Holmes et al. [210] geeft een korte reactietijd van natriumbisulfiet namelijk minder aanleiding tot fragmentatie. In dit artikel
worden naast de ’EZ Methylation Lightning™ Kit’ ook nog andere kits voor bisulfietconversie van DNA beschreven waarbij zelfs nog kortere reactietijden gebruikt worden.
Aangezien deze kortere tijd zou kunnen leiden tot een afname van de fragmentatie, is
het bijgevolg ook aangeraden om deze andere kits (’EpiTect Fast FFPE Kit’, ’EpiTect
Fast DNA Bisulfite Kit’, en de ’InnuCONVERT Bisulfite kit family’) uit het artikel uit
te testen op het HIV-DNA. Holmes et al. geven ook aan dat de overige specificaties zoals conversie-efficiëntie, opbrengst,... van deze kits zijn vergelijkbaar met die van de ’EZ
Methylation Lightning™ Kit’.
De PCR die werd uitgevoerd in het onderzoek is een touch down PCR. Daarbij werden
er eerst vijf cycli uitgevoerd met een annealingstemperatuur van 60°C, vervolgens vijf
cycli met een annealingstemperatuur van 55°C, om pas dan aan de 30 tot 50 cycli van
52°C te komen. Indien de annealingstemperatuur hoger is, zal de specificiteit van de
reactie hoger zijn, maar de efficiëntie lager. Tijdens de eerste tien cycli is het dus de
bedoeling om zeer specifiek de amplicons waarvoor de primers zijn ontwikkeld al enkele
keren te amplificeren. Na deze tien cycli is de annealingstemperatuur lager, waardoor de
51
efficiëntie van de PCR-reactie zal verhogen, maar de specificiteit zal verlagen. Door de
initiële vermeerdering van de specifieke gewenste fragmenten, daalt de kans dat er aspecifieke fragmenten in het finale product zullen zitten. Ondanks de grote variabiliteit van
HIV binnen en tussen patiënten, werd toch geopteerd om de DNA-kopijen die perfect
overeenkomen initieel te vermeerderen. De primers werden immers zo gekozen dat ze
exact overeen kwamen met de bisulfiet geconverteerde sequentie van de meeste gekende
HIV-strengen die zijn opgenomen in de databank van ’Los Alamos National laboratory’
(http://www.hiv.lanl.gov/content/index). Er zou dus in principe in meer dan 55-60%
van de HIV-kopijen een exacte match moeten voorkomen. In het geval dat er geen exacte
overeenkomst is, zal in de 30 tot 50 cycli wel nog genoeg PCR-product kunnen gevormd
worden. De specificiteit is daar niet even hoog, maar nog steeds hoog genoeg om ervan
uit te gaan dat de juiste fragmenten worden gevormd.
4.2
Analyse van HIV-methylatie in vitro en in vivo
Van de 24 PCR-producten die werden geselecteerd uit de stalen van de SupT1-cellijnen gaven er slechts 17 een resultaat. Aangezien deze stalen op voorhand geamplificeerd werden
met PCR, en dat bij alle 24 stalen een PCR-product werd gedetecteerd, werd verwacht
dat elk staal toch zeker resultaten zou geven met hoge coverage. Wellicht is er bij de
stalen die geen resultaat gaven, alsook bij de stalen met een lage coverage (<100 reads)
iets misgelopen bij de opzuivering of bij het samenvoegen van de stalen.
Voor de SupT1 cellijnen die een actieve, primaire HIV-infectie ondergingen, werd verwacht
dat ze weinig methylatie zouden vertonen. In de literatuur werd reeds beschreven dat een
actieve infectie in cellijnen gepaard gaat met hypomethylatie van de CpG-eilanden LTR
en NCR in het virale genoom. Bovendien kan verondersteld worden dat door het feit
dat er een primaire infectie plaatsvond, de methylatiegraad vrij laag zou zijn aangezien
er geen tijd was om veel methylatie uit te voeren op het HIV-genoom. Uit de resultaten
blijkt inderdaad dat de methylatiegraad in en rond het 5’-LTR laag is. Slechts 3 van de
17 geanalyseerde stalen vertonen een gemengd methylatieprofiel met op enkele posities
meer dan 60% methylatie. Twee van die drie stalen kwamen uit een batch waarvan negen
stalen werden geanalyseerd. In deze batch waren er vier stalen die info gaven over de
regio van het CpG-eiland NCR, en twee ervan vertonen hogere methylatie op meerdere
C-residu’s. Deze batch DNA vertoonde wellicht een hogere CpG-methylatie ter hoogte
van het NCR-CpG-eiland dan de andere batchen, waar de methylatie overal laag is. Een
andere verklaring kan zijn dat de bisulfietconversie geen 100% efficiëntie vertoonde. Bij
de drie stalen die een gemengd methylatieprofiel vertonen werd inderdaad gezien dat tot
30% van de niet-CpG cytosines niet werden omgezet tijdens de bisulfietbehandeling.
De testen op deze cellijnen waren voornamelijk uitgevoerd om het volledige protocol uit te
testen voordat effectief met patiëntenstalen verder ging gewerkt worden. Uit de post-hoc
analyse kunnen we door het lage aantal stalen, een ontoereikend experimenteel design
en de lage coverage op enkele van de stalen de besluiten uit de literatuur niet meteen
bevestigen of tegenspreken. Aangezien er bij 14 van de 17 stalen enkel hypomethylatie
werd aangetroffen op het DNA, kon wel worden aangenomen dat er bij onze stalen ook
effectief weinig CpG-methylatie had plaatsgevonden. Dit werd op basis van de literatuur
52
ook verwacht. Aangezien we van de meeste stalen resultaten verkregen die ongeveer binnen het verwachtingspatroon lagen, kon de assay verder getest worden op de stalen van
het latentiemodel en op patiëntenstalen.
Bij de testen op de stalen uit het latentiemodel en bij de patiëntenstalen was de coverage
van de sense strengen telkens zeer hoog, maar die van de antisense strengen was telkens
laag. Nochtans werden er na PCR equimolaire hoeveelheden amplicons toegevoegd van
de sense streng en van de antisense streng. Er zou dus verwacht worden dat de coverage
van beide strengen ongeveer gelijk zou zijn. Aangezien de coverage van de sense streng
heel hoog is, en die van de antisense zeer laag, werd telkens naast de analyse van alle data
ook een analyse uitgevoerd met enkel de data van de CpG-residu’s van de sense strengen.
Daardoor verkrijgen we minder informatie, maar de info is wel betrouwbaarder.
De testen op het latentiemodel en op de patiëntenstalen werden uitgevoerd om aan te
tonen dat de volledige assay niet enkel op SupT1-cellijnen werkt, maar ook op ander celmateriaal. Van het latentiemodel was het door omstandigheden niet mogelijk om stalen te
krijgen van zowel voor als na de reactivatie van de CD4+ T-cellen en van de CD4- T-cellen.
Er werden wel stalen verkregen van gereactiveerde CD4+ T-cellen en niet-gereactiveerde
CD4- T-cellen. De methylatiepatronen op het DNA van deze twee verschillende types
cellen werden wel met elkaar vergeleken in een post-hoc analyse. De patiëntenstalen werden zo geselecteerd dat er verschillende types patiënten in de testen werden opgenomen.
Er waren stalen van patiënten die op het moment van staalname geen behandeling tegen HIV ondergingen, en andere patiënten die wel medicatie namen. Van de patiënten
onder HAART waren er die nog niet lang behandeld werden (2-3 jaar), terwijl anderen
wel al lang HAART namen (tot 15 jaar). Tijdens een post-hoc analyse werden de stalen
van patiënten onder therapie vergeleken met de stalen van de naı̈eve patiënten, en werd
ook het effect van de duur van de medicatie op de CpG-methylatie bekeken. Om echt
iets te kunnen besluiten over de differentiële methylatie tussen de verschillende groepen
patiënten zijn deze stalen echter niet voldoende. Er zijn niet enkel te weinig stalen (16
patënten), maar er is ook weinig belang gehecht aan een experimenteel design waarbij
bepaalde stalen gekozen waren om een interessante vergelijking mee te maken.
Het hoofddoel van de testen op deze verschillende stalen was eerder om aan te tonen dat
de ontwikkelde assay effectief werkt. Doordat we de assay vrij succesvol hebben getest op
verschillende types stalen (SupT1-cellijnen, geı̈nfecteerde CD4+ en CD4- T-cellen van het
latentiemodel en een variatie aan patiëntenstalen), werd dan ook aangetoond dat we via
de huidige assay in staat zijn om een methylatieprofiel op te stellen van HIV in verschillende omstandigheden. Deze assay heeft als voordeel dat door de next generation deep
sequencing veel informatie over de verschillende patiënten kan verkregen worden op relatief korte tijd. Tijdens dit onderzoek hebben we ondervonden dat er per patiëntenstaal tot
meer dan 300 unieke sequenties geanalyseerd werden om de methylatiestatus te bepalen
(data niet weergegeven). Dit is een hele vooruitgang tegenover vorig onderzoek waar ook
de methylatiestatus van HIV werd bepaald. In deze onderzoeken moest het te analyseren
DNA vaak eerst nog in een vector die universele primers bevat gekloneerd worden na
amplificatie met PCR, om vervolgens het DNA te sequeneren. Met deze techniek kunnen
er veel minder sequenties worden geanalyseerd op dezelfde tijd dan bij de methode die in
dit onderzoek werd gebruikt.
53
Het DNA verkregen uit de stalen van het latentiemodel vertoonde hogere methylatie op
de meeste C-residu’s van het CpG-eiland NCR dan het DNA uit de SupT1 cellijnen. Dit
komt overeen met onze verwachtingen, aangezien in de literatuur al beschreven is dat in
de cellen van het latentiemodel meer methylatie voorkomt op de CpG-eilanden. Zeker
op de C-residu’s die aan de buitenkanten van het CpG-eiland voorkomen is een hoog
methylatiepercentage te zien. Enkel op 718 C werd hypomethylatie teruggevonden. De
verhoogde methylatie zou enerzijds kunnen verklaard worden door het feit dat in deze
cellen, in tegenstelling tot bij de SupT1 cellen, de enzymen die verantwoordelijk zijn voor
de methylatie van de CpG’s (DNMT), wel de tijd hebben gehad om de methylatie uit
te voeren. Anderzijds kan ook worden aangenomen dat de CpG-methylatie een respons
is van de cel op de omstandigheden waarin hij zich tijdens het model bevindt. Dit zou
betekenen dat de methylatie effectief van belang is voor de latentie van HIV.
Binnen de stalen van het latentiemodel werd ook gekeken of er differentiële methylatie
terug te vinden was tussen de verschillende types cellen. In de literatuur werd al beschreven dat in latentiemodellen de CpG-eilanden LTR en NCR van het HIV-genoom in latent
geı̈nfecteerde cellen meer methylatie vertonen dan actief geı̈nfecteerde cellen. Ook in dit
onderzoek werd differentiële methylatie teruggevonden tussen de gereactiveerde CD4+ Tcellen enerzijds, en de niet-gereactiveerde CD4- T-cellen anderzijds. Deze twee celtypes
ondergaan weliswaar allebei een actieve infectie, maar de CD4+ T-cellen waren voor de
reactivatie wel nog latent geı̈nfecteerd. Over het algemeen (op 11 van de 12 C’s waar een
significant verschil werd waargenomen) vertoonde dit laatste type cellen meer methylatie (tot 2.5% per C). Dit resultaat strookt met de hypothese dat CpG-methylatie in in
vitro-modellen zou zorgen voor de inactivatie van de virale replicatie. De CD4- T-cellen
waren al van in het begin actief geı̈nfecteerd, en vertoonden dus minder methylatie. Het
HIV in de CD4+ T-cellen daarentegen was voor de reactivatie (tijdens de latente infectie)
wellicht sterker gemethyleerd. Volgens dit model zou door de reactivatie (een deel van)
de methylatie moeten verloren gaan opdat het virus actief kan repliceren. De methylatie kan in deze stalen wel nog iets hoger liggen doordat er nog een aantal cellen latent
geı̈nfecteerd zullen blijven, of de methylatie zou op de korte tijd van dit model nog niet
volledig kunnen verloren gaan zijn. Deze tweede verklaring zou betekenen dat voor de
reactivatie van het virus niet volledig het omgekeerde proces plaatsvindt als tijdens het
induceren van latentie, zoals werd voorgesteld in sectie 1.3. Helaas kan het verschil voor
en na reactivatie van de CD4+ T-cellen niet worden aangetoond, aangezien we geen DNA
konden krijgen van voor de reactivatie. Maar het feit dat in deze cellen, waar het virus
in het eerste stadium een latente infectie veroorzaakte, meer methylatie voorkomt dan in
cellen waar de infectie altijd actief was, kan een aanwijzing zijn dat de latentie effectief
gelinkt is aan CpG-methylatie. Zoals al eerder aangegeven kan uit deze data niets met
zekerheid worden besloten. Dit was niet het hoofddoel van de testen met het latentiemodel, en daarvoor is de proefopzet niet voldoende uitgebreid. Enerzijds kijken we slechts
naar één van de twee CpG-eilanden die volgens Chávez et al. [109] een belangrijke rol
zouden kunnen spelen in een latentiemodel: er werd enkel naar het CpG-eiland NCR
gekeken, terwijl ook LTR een belangrijke rol zou kunnen spelen. Anderzijds werden er
niet voldoende stalen geanalyseerd en was de diversiteit van celtypes niet groot genoeg.
54
Het DNA uit de patiëntenstalen vertoonde gemiddeld nog meer methylatie op de Cresidu’s aan de uiteinden van het CpG-eiland NCR dan de stalen uit het latentiemodel.
Centraal in het CpG-eiland daarentegen werd minder methylatie teruggevonden dan bij
het latentiemodel, maar de methylatie was, uitgezonderd op 718 C, beduidend hoger dan
de methylatie op de SupT1-cellijnen. In patiënten hebben de DNMT-enzymen in de cellen zeker voldoende tijd om de methylatie op het DNA te vervolledigen, en aangezien er
binnen elke patiënt zeker latent geı̈nfecteerde cellen zullen voorkomen, is het niet verwonderlijk dat de methylatie hier hoog is. DNA-methylatie wordt bij zoogdieren als een van
de afweermechanismen tegen retrovirussen gezien [16, 19], dus in alle patiënten (zelfs in
patiënten die geen medicatie nemen) zal minstens een deel van het aanwezige HIV-DNA
hypermethylatie vertonen. Bij de patiëntenstalen werd de invloed van de activiteit van het
virus op het methylatieprofiel van het CpG-eiland NCR bekeken. De groep patiënten werd
daarvoor opgesplitst in een subgroep met patiënten die een actieve infectie ondergingen
en een subgroep met individuen die een latente infectie ondergingen. Er is weinig geweten
over de achtergrond van de patiënten en over hoe consequent ze hun medicatie nemen.
Er is overigens niet geweten hoe lang de patiënten geı̈nfecteerd zijn. Toch werd ervan
uitgegaan dat de geı̈nfecteerde cellen van de patiënten die op het moment van staalname
onder therapie stonden allemaal latent geı̈nfecteerd waren. Tussen de patiënten die niet
onder therapie stonden kon geen onderscheid maken tussen long term non progressors,
rapid progressors,... Bij deze groep werd er bijgevolg van uit gegaan dat het virus actief
repliceert in een deel van de geı̈nfecteerde cellen, en dat het daarnaast ook cellen latent
infecteert als gevolg van het afweermechanisme van de patiënt.
Tussen deze twee groepen werden op 14 van de 15 geanalyseerde CpG’s significante verschillen in methylatie waargenomen. 10 van deze CpG’s vertoonden minder methylatie
bij patiënten die therapie volgden tijdens staalname dan bij de naı̈eve patiënten. Dit is
een aanwijzing dat de regulatie van de latentie in patiënten anders verloopt dan bij de
celculturen, waar meer methylatie minder replicatie lijkt te veroorzaken. Op de clusteranalyse en de PCA is te zien dat er bij de patiënten op therapie meer variatie op het
methylatiepatroon van het CpG-eiland NCR voorkomt dan bij de naı̈eve patënten. Dit
zou kunnen aantonen dat de latentie niet overal door hetzelfde methylatiepatroon wordt
veroorzaakt. Dit is anderzijds ook een aanwijzing dat de assumpties voor het opdelen van
de subgroepen niet volledig kloppen, en dat niet alle geı̈nfecteerde cellen in patiënten op
therapie een latente infectie ondergaan. Zoals eerder al werd aangegeven zijn ook deze
resultaten niet sterk genoeg om iets te bewijzen. Daarvoor hebben we namelijk te weinig
stalen, maar er werd ook slechts naar één CpG-eiland op één van de DNA-strengen gekeken. Bovendien waren de gekozen stalen niet per se relevant voor een dergelijk onderzoek
en hebben we een aantal zaken moeten aannemen bij het indelen van de groepen. Het
doel van het sequencen van deze stalen was voornamelijk om aan te tonen dat de hele
assay om het methylatiepatroon van het HIV-DNA in patiënten te bepalen werkte.
Toch werd nog een laatste post-hoc analyse uitgevoerd op de gesequeneerde stalen waaruit
om dezelfde redenen als hierboven beschreven niets definitief kan besloten worden. Van de
groep patiënten die medicatie nemen is wel geweten hoe lang ze al medicatie nemen. Er
werd daarom ook nagegaan of de tijdsduur van HAART een effect heeft op de methylatie
van het NCR CpG-eiland. Daarvoor werd de groep van patiënten op HAART opgedeeld
in 2 subgroepen waarbij in de eerste groep de patiënten 2 tot 3 jaar therapie ondergaan,
en de tweede subgroep bestond uit patiënten die langer dan 3 jaar medicatie nemen. De
55
duur van de therapie bleek een kleine invloed te hebben op de methylatie. Op de 4 C’s
waar er een significant verschil werd gedetecteerd tussen de twee groepen, was dit verschil
kleiner dan 1%. Het feit dat er zeer weinig verschil optreedt tussen deze twee groepen
kan wellicht verklaard worden doordat al deze patiënten hun medicatie correct innemen,
en dat ze allemaal de infectie onder controle hebben. Dit zou ook betekenen dat de CpGmethylatie van het virus (in het NCR CpG-eiland) niet meer zal veranderen zolang de
patiënt de medicatie correct blijft innemen. Het verder onderzoek zou daardoor vergemakkelijken aangezien dan alle mensen op therapie als gelijk kunnen worden beschouwd
wat betreft de methylatiegraad. Echter, in de clusteranalyse en de PCA is aangetoond
dat er binnen deze groep wel nog vrij veel variatie voorkomt in de methylatiepatronen van
de patiënten onderling. Deze variatie zal wellicht enigszins ad random voorkomen, maar
er dient wel rekening mee gehouden te worden in verder onderzoek.
Ondanks het feit dat er uit voorgaande post-hoc analyses niets definitief kan besloten
worden, geven ze wel een aanwijzing dat er een verschil is tussen de methylatiepatronen
van HIV-genomen in latent en actief geı̈nfecteerde cellen. Er wordt dus aangetoond dat er
waarschijnlijk een verband zal zijn tussen de latentie en de CpG-methylatie in het HIVgenoom. Daardoor kunnen we aannemen dat de methylatie van de CpG-eilanden zeker de
moeite waard is om verder te onderzoeken. Aan de hand van de assay die tijdens dit onderzoek werd ontwikkeld kan van een grote cohorte HIV-patiënten het methylatiepatroon
van het CpG-eiland NCR worden geanalyseerd. Voor deze analyse kan er een goed experimenteel design uitgedacht worden waardoor er duidelijkheid zal kunnen worden geschept
in het verband tussen de methylatie en de latentie. De eerste testen om ook het CpGeiland LTR te amplificeren en te sequeneren waren veelbelovend. Echter naarmate de
concentratie HIV-DNA lager werd, werkte deze test minder en minder goed. Uiteindelijk
was het nog niet mogelijk om deze regio op patiëntenmateriaal te sequeneren, maar mits
een optimalisatie van de PCR, zou ook deze regio op de groep patiënten kunnen worden
geamplificeerd en vervolgens gesequeneerd. Tijdens dit onderzoek werden ook al de eerste
testen uitgevoerd om nog andere CpG-eilanden in het virale genoom te amplificeren. In
het genoom van HIV zijn er verschillende locaties waar de CpG-densiteit relatief hoog
is. Deze regio’s zijn vaak echter te klein om echt over een CpG-eiland te spreken, maar
ook daar kan DNA-methylatie optreden. Voor de meeste van deze regio’s werden er al
primers ontwikkeld voor de sense streng en werden amplicons gegenereerd op stalen met
een hoge concentratie HIV-DNA (deze data zijn niet weergegeven). Uiteindelijk hebben
we ons binnen dit onderzoek voornamelijk gefocust op de CpG-eilanden LTR en NCR
aangezien deze regio’s gelegen zijn rond de promotorregio en de transcriptie start site
van het HIV-genoom. In deze regio’s zal de DNA-methylatie waarschijnlijk meer invloed
hebben op de activiteit van virale replicatie dan in de overige regio’s.
Echter, zoals in sectie 1.1.5 al werd aangegeven, is er wellicht ook regulatie van de latentie
aan de hand van andere epigenetische modificaties dan enkel DNA-methylatie. Daardoor
zal er misschien niet zomaar een oorzakelijk verband gevonden worden tussen latentie
en DNA-methylatie. Deze epigenetische modificaties zouden naast de CpG-methylatie
ook moeten onderzocht worden om een totaalbeeld te krijgen van het mechanisme van
latentie, en de rol van de methylatie binnen dit mechanisme te begrijpen.
56
5.
Conclusie en verder onderzoek
In deze masterproef werd een assay ontwikkeld waarmee aan de hand van next generation
deep sequencing een methylatieprofiel kan worden opgesteld van het CpG-eiland NCR in
het HIV-genoom van patiënten. Deze assay is gebaseerd op de behandeling van DNA van
HIV-geı̈nfecteerde cellen met natriumbisulfiet. Dat geconverteerde DNA wordt vervolgens
geamplificeerd via PCR, waarna het wordt gesequeneerd. Vervolgens kan een methylatieprofiel worden opgesteld van de gesequeneerde regio. De methylatie van de CpG-eilanden
NCR en LTR in het genoom van HIV-1 is volgens een aantal onderzoeken van belang
bij de regulatie van de latentie van de HIV-infectie. Deze latentie is op dit moment de
voornaamste oorzaak dat HIV nog steeds een infectie veroorzaakt die niet te genezen is.
In eerder onderzoek werden data gegenereerd aan de hand van low throughput technieken
zoals klonale expansie en Sanger sequencing, en vaak werd daar enkel naar in vitro stalen
gekeken. In tegenstelling tot de assays van deze onderzoeken, maakt de test die hier ontwikkeld werd gebruik van high throughput technieken, en kan van DNA van HIV-patiënten
een methylatieprofiel opgesteld worden. Testen op patiëntenmateriaal zijn noodzakelijk
indien men echt iets wil besluiten over de mechanismen van het virus in vivo. Echter,
door de variabiliteit van het virus en door de lage concentratie viraal DNA in patiënten
is het helemaal niet evident om testen op die patiënten uit te voeren. Met deze nieuwe
assay was het mogelijk om zowel van SupT1 cellijnen, CD4+ T-cellen uit een latentiemodel, CD4- T-cellen uit een latentiemodel als van alle geteste patiënten die al dan niet op
therapie stonden op het moment van staalname, een methylatieprofiel op te stellen. Mits
enkele aanpassingen zal de assay ook bruikbaar zijn met andere primerparen, waardoor
de methylatie op verschillende regio’s van het HIV-genoom kan geanalyseerd worden. Bovendien zal de assay kunnen uitgebreid worden naar gelijkaardige testen op andere targets
dan HIV.
De post hoc-analyses op de stalen die werden gebruikt om de assay te testen, geven een
aanwijzing dat de CpG-methylatie effectief varieert in verschillende types stalen. Dit toont
aan dat verder onderzoek naar de methylatiestatus in patiënten wel degelijk waardevolle
informatie zou kunnen opleveren. Voor dit onderzoek vormt de test die in deze thesis
beschreven is zeker een goede basis.
In de toekomst zijn er dus nog vele mogelijkheden voor verder onderzoek. De afzonderlijke
testen zoals de bisulfietbehandeling en de PCR kunnen bijvoorbeeld verder geoptimaliseerd worden, maar ook een multiplex assay zou in de toekomst verder kunnen uitgewerkt
worden. Bovendien zou het interessant zijn om ook naar andere CpG-eilanden in het
HIV-genoom te kijken dan enkel naar NCR. Uiteraard zal het nuttig zijn om de geoptimaliseerde test uit te voeren op een grotere groep patiënten om het verband aan te
57
58
tonen tussen methylatie en latentie. Er zou tevens kunnen gezocht worden naar andere
epigenetische modificaties binnen het HIV-1-genoom zoals histon modificaties, en welke
rol zij spelen in de latentie van het virus. Ten slotte zou ook de epigenetische status van
de gastheer kunnen onderzocht worden om het volledige mechanisme te doorgronden.
Het verband tussen de epigenetische status en de latentie zou dan kunnen gebruikt worden in de ontwikkeling van een merker voor de activiteit van het virus, of zelfs voor de
eliminatie van HIV uit het lichaam van de patiënt.
Met de huidige test is het enkel mogelijk om van het CpG-eiland NCR een methylatieprofiel op te stellen. Een verdere optimalisatie en ontwikkeling van de afzonderlijke
delen van de assay zou echter kunnen resulteren in een assay waarbij van een groot aantal patiënten op redelijk korte tijd een methylatiepatroon van meerdere CpG-eilanden
kan bepaald worden. De bisulfietbehandeling kan aangepast worden zodat de fragmentatie minimaliseert, maar ook de PCR-reacties kunnen verder geoptimaliseerd worden.
Door deze optimalisatie zouden langere regio’s ook kunnen worden geamplificeerd indien
de concentratie HIV-DNA laag is. Daarvoor kunnen er primerparen gezocht worden die
efficiëntere amplificatie veroorzaken, maar ook de parameters van de PCR zoals temperaturen, tijdsschema, samenstelling van de mastermix,... kunnen verder geoptimaliseerd
worden. Ideaal zou zijn dat een multiplex PCR kan worden ontwikkeld die, naast het
CpG-eiland van de NCR, nog meer regio’s zowel op de sense als op de antisense streng
zou amplificeren. Om de variatie in de HIV-genomen op te vangen is het tevens aangeraden om per regio verschillende primerparen te ontwikkelen. Indien aan de hand van deze
geoptimaliseerde assay van een grote groep patiënten een methylatiepatroon wordt opgesteld, zou er wellicht iets kunnen besloten worden over de volledige populatie van HIV-1,
en zal er een oorzakelijk verband kunnen gezocht worden tussen de CpG-methylatie en
de latentie in HIV.
Tijdens dit onderzoek lag de focus uitsluitend op de DNA-methylatie om de oorzaak van
de latentie te vinden. Het kan ook zeker nuttig zijn om andere epigenetische modificaties
die plaatsvinden op het genoom van HIV-1 te analyseren en in kaart te brengen. Latentie wordt namelijk waarschijnlijk veroorzaakt door een hele reeks van epigenetische
modificaties die samenwerken om zo de transcriptie van bepaalde genen te inhiberen. Er
zijn wel vrij veel aanwijzingen dat de CpG-methylatie daar van groot belang is, maar om
een volledig beeld te krijgen van het mechanisme is het zeker aan te raden om ook andere epigenetische modificaties te bestuderen. Als al deze mechanismen parallel in kaart
kunnen gebracht worden, kan niet enkel de link tussen deze modificaties en de latentie
uitgepluisd worden, maar ook de link tussen de verschillende epigenetische modificaties
onderling. Indien deze wisselwerking tussen de verschillende modificaties zou begrepen
worden, kan toch eventueel één van deze epimutaties als merker gebruikt worden om de
totale epigenetische status van HIV binnen een patiënt in kaart te brengen.
Ook de (epi)genetische status van de gastheer zou van belang kunnen zijn voor de latentie van HIV-1. Afhankelijk van de locatie in het gastheergenoom waar het virale genoom
integreert en van de epigenetische status van het DNA in de geı̈nfecteerde cel, zal de cel
wellicht een ander effect uitoefenen op het virale DNA, waardoor de activiteit van de virale
replicatie zou kunnen veranderen. In verder onderzoek zou dus ook uitgezocht moeten
worden welke rol de epigenetische status van de gastheercellen speelt in de latentie van
het virus.
59
Indien er een duidelijk verband kan worden aangetoond tussen de DNA-methylatie (of andere epimutaties) op het virale genoom of op het gastheergenoom enerzijds, en de latentie
van HIV-1 anderzijds, zou deze epigenetische status in patiënten kunnen gebruikt worden
als een merker voor de replicatie-activiteit van HIV-1. De test zou de DNA-methylatie
en/of een andere epigenetische modificatie van een specifieke regio moeten bepalen op een
patiëntenstaal. De DNA-methylatie bepalen in patiëntenstalen is exact wat gebeurt in de
test die tijdens dit onderzoek werd ontwikkeld. Aan de hand van de resultaten kan dan
besloten worden hoe actief de virussen in de patiënt zijn. Tijdens de ontwikkeling van deze
merker zal het van groot belang zijn om verschillende regio’s te analyseren. Men moet
daarbij zeker ook beseffen dat de interactie tussen epimutaties op verschillende locaties
binnen het genoom ook een rol zou kunnen spelen.
Het ultieme doel van het onderzoek is om de latentie van HIV-1 volledig te doorgronden. Momenteel wordt de latentie van HIV-1 gezien als het belangrijkste obstakel om
HIV-infecties volledig te elimineren uit patiënten. Eenmaal het epigenetisch mechanisme
achter de latentie van het virus volledig gekend is, kan naar specifieke epimutaties worden
gezocht waarmee de latentie ongedaan kan gemaakt worden. Epigenetische veranderingen kunnen aangebracht worden of ongedaan gemaakt worden door een epigenetic editing
tool. Op die manier kan bijvoorbeeld methylatie geı̈nduceerd worden of net ongedaan
gemaakt worden. Aangezien we enkel specifieke epimutaties willen targetten moeten de
epigenetic editing-enzymes gericht worden tegen specifieke genomische sequenties van het
virus. Dit kan met de hulp van TALEN of CRISPR/Cas9 systemen. Deze technieken
maken gebruik van respectievelijk fusie-eiwitten en van guideRNA om een eiwit tot bij
een bepaalde DNA-sequentie te brengen. Indien het TALEN of CRISPR/Cas-systeem
gekoppeld wordt aan een epigenetic editing-enzyme (TALEGE/CRISPREGE), kunnen
zeer specifieke epimutaties worden aangebracht in de patiënten. Als door de epimutaties
te veranderen, de latentie van het virus kan worden ongedaan gemaakt, zal de replicatie
van het virus terug in gang gezet worden. Door een combinatie van de activatie van het
virus aan de hand van epigenetic editing, en therapie die de replicatie net tegengaat zou
de infectie kunnen worden genezen. Indien deze aanpak zou werken, kunnen op dezelfde
manier ook andere virale infecties waarbij latentie een belangrijke rol speelt bestreden
worden.
60
Bibliografie
[1] M. S. Gottlieb, R. Schroff, H. M. Schanker, J. D. Weisman, P. T. Fan, et al. Pneumocystis carinii pneumonia and
mucosal candidiasis in previously healthy homosexual men: evidence of a new acquired cellular immunodeficiency.
The New England journal of medicine, 305(24):1425–1431, 1981.
[2] F. Barre-Sinoussi, J. Chermann, F. Rey, M. Nugeyre, S. Chamaret, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus
from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science, 220(4599):868–871, 1983.
[3] R. Gallo, P. Sarin, E. Gelmann, M. Robert-Guroff, E. Richardson, et al. Isolation of human T-cell leukemia virus in
acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science, 220(4599):865–867, 1983.
[4] WHO. Size of the epidemic. http://www.who.int/gho/hiv/epidemic_status/en/, laatst geraadpleegd op 2015-03-11,
2015.
[5] SENSOA.
Feiten & cijfers:
Hiv-diagnoses in België.
http://www.sensoa.be/feiten-en-cijfers/
feiten-cijfers-hiv-diagnoses-belgie, laatst geraadpleegd op 2015-03-12, 2015.
[6] C. A. Janeway, P. Travers, M. Walport, and M. J. Shlomchick. Janeway’s Immunobiology. Garland Publishing, New
York, 5th edition, 2001.
[7] D. Persaud, T. Pierson, C. Ruff, D. Finzi, K. R. Chadwick, et al. A stable latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+
T lymphocytes in infected children. Journal of Clinical Investigation, 105(7):995–1003, 2000.
[8] D. Trono, C. Van Lint, C. Rouzioux, E. Verdin, F. Barré-sinoussi, et al. HIV Persistence and the Prospect of
Long-Term Drug-Free Remissions for HIV-Infected Individuals. Science, 329(5988):174–180, 2010.
[9] A. S. Fauci, H. Masur, E. P. Gelmann, P. D. Markham, B. H. Hahn, et al. The Acquired Immunodeficiency Syndrome:
An Update. Annals of Internal Medicine, 102(6):800–813, 1985.
[10] G. Pantaleo and A. S. Fauci. Immunopathogenesis of hiv infection. Annual review of microbiology, 50(1):825–854,
1996.
[11] D. R. Forsdyke. Programmed activation of T-lymphocytes. A theoretical basis for short term treatment of AIDS with
azidothymidine. Medical Hypotheses, 34(1):24–27, 1991.
[12] L. Geeraert, G. Kraus, and R. J. Pomerantz. Hide-and-seek: the challenge of viral persistence in HIV-1 infection.
Annual review of medicine, 59:487–501, 2008.
[13] S. P. Goff. The Retroviruses and Their Replication. In FieldsVirology, volume 1, chapter 57, pages 1519–1576.
Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 4th edition, 2001.
[14] A. Jordan, P. Defechereux, and E. Verdin. The site of HIV-1 integration in the human genome determines basal
transcriptional activity and response to Tat transactivation. The EMBO Journal, 20(7):1726–1738, 2001.
[15] R. Holliday. Epigenetics: an overview. Developmental genetics, 15(6):453–457, 1994.
[16] A. P. Wolffe and M. A. Matzke. Epigenetics : Regulation Through Repression. Science, 286(5439):481–486, 1999.
[17] J. Hejnar, J. Plachý, J. Geryk, O. Machon, K. Trejbalová, et al. Inhibition of the rous sarcoma virus long terminal
repeat-driven transcription by in vitro methylation: different sensitivity in permissive chicken cells versus mammalian
cells. Virology, 255(1):171–181, 1999.
[18] J. Hejnar, P. Hájková, J. Plachy, D. Elleder, V. Stepanets, et al. CpG island protects Rous sarcoma virus-derived
vectors integrated into nonpermissive cells from DNA methylation and transcriptional suppression. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(2):565–569, 2001.
[19] E. Jablonka and M. J. Lamb. The changing concept of epigenetics. Annals of the New York Academy of Sciences,
981(1):82–96, 2002.
[20] D. P. Bednarik, J. D. Mosca, and N. B. Raj. Methylation as a modulator of expression of human immunodeficiency
virus. Journal of Virology, 61(4):1253–1257, 1987.
[21] D. P. Bednarik, J. A. Cook, and P. M. Pitha. Inactivation of the HIV LTR by DNA CpG methylation: evidence for
a role in latency. The EMBO Journal, 9(4):1157–1164, 1990.
[22] N. Clumeck, F. Mascart-Lemone, J. De Mauberge, D. Brenez, and L. Marcelis. Acquired immune deficiency syndrome
in Black Africans. The Lancet, 1(8325):642, 1983.
[23] P. Van de Perre, D. Rouvroy, P. Lepage, J. Bogaerts, P. Kestelyn, et al. Acquired immunodeficiency syndrome in
Rwanda. The Lancet, 2(8394):62–65, 1984.
[24] P. Piot, H. Taelman, T. C. Quinn, F. M. Feinsod, K. B. Minlangu, et al. Acquired immunodeficiency syndrome in a
heterosexual population in Zaire. The Lancet, 2(8394):65–69, 1984.
[25] J. Marx. A virus by any other name. Science, 227(4693):1449–1451, 1985.
[26] J. Coffin, A. Haase, J. A. Levy, L. Montagnier, S. Oroszlan, et al. What to call the AIDS virus? Nature, 321(6065):10,
1986.
[27] F. Barin, F. Denis, J. S. Allan, S. M’Boup, P. Kanki, et al. Serological evidence for virus related to Simian Tlymphotropic retrovirus III in residents of West Africa. The Lancet, 326(8469-8470):1387–1389, 1985.
[28] F. Clavel. HIV-2, the West African AIDS virus. AIDS (London, England), 1(3):135–140, 1987.
61
62
[29] F. Simon, S. Matheron, C. Tamalet, I. Loussert-Ajaka, S. Bartczak, et al. Cellular and plasma viral load in patients
infected with HIV-2. AIDS (London, England), 7(11):1411–1417, 1993.
[30] P. A. Andreasson, F. Dias, A. Nauclér, S. Andersson, and G. Biberfeld. A prospective study of vertical transmission
of HIV-2 in Bissau, Guinea-Bissau. AIDS (London, England), 7(7):989–993, 1993.
[31] G. Adjorlolo-Johnson, K. M. De Cock, E. Ekpini, K. M. Vetter, T. Sibailly, et al. Prospective Comparison of
Mother-to-Child Transmission of HIV-1 and HIV-2 in Abidjan, Ivory Coast. The Journal of the American Medical
Association, 272(6):462–466, 1994.
[32] R. Marlink, P. Kanki, I. Thior, K. Travers, G. Eisen, et al. Reduced rate of disease development after HIV-2 infection
as compared to HIV-1. Science, 265(5178):1587–1590, 1994.
[33] P. J. Kanki, K. U. Travers, S. Mboup, C. C. Hsieh, R. G. Marlink, et al. Slower heterosexual spread of HIV-2 than
HIV-1. The Lancet, 343(8903):943–946, 1994.
[34] The HIV Infection in Newborns French Collaborative Study Group. Comparison of vertical human immunodeficiency
virus type 2 and human immunodeficiency virus type 1 transmission in the French prospective cohort. The Pediatric
Infectious Disease Journal, 13(6):502–506, 1994.
[35] T. Prazuck, J. M. Yameogo, B. Heylinck, L. T. Ouedraogo, A. Rochereau, et al. Mother-to-child transmission of
human immunodeficiency virus type 1 and type 2 and dual infection: a cohort study in Banfora, Burkina Faso. The
Pediatric Infectious Disease Journal, 14(11):940–947, 1995.
[36] S. J. Popper, A. D. Sarr, K. U. Travers, A. Guèye-Ndiaye, S. Mboup, et al. Lower human immunodeficiency virus
(HIV) type 2 viral load reflects the difference in pathogenicity of HIV-1 and HIV-2. The Journal of Infectious
Diseases, 180(4):1116–1121, 1999.
[37] D. L. Robertson, J. P. Anderson, J. A. Bradac, J. K. Carr, B. Foley, et al. HIV-1 Nomenclature Proposal. Science,
288(5463):55, 2000.
[38] J. Hemelaar, E. Gouws, P. D. Ghys, and S. Osmanov. Global and regional distribution of HIV-1 genetic subtypes
and recombinants in 2004. AIDS (London, England), 20(16):W13–W23, 2006.
[39] C. Calef, J. Mokili, D. H. O. Connor, D. I. Watkins, and B. Korber. Numbering Positions in SIV Relative to SIVMM239 ( revised *). Beschikbaar op http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/REVIEWS/SIV_
NUMBERING2001/SivNumbering.html, 2005.
[40] G. B. K. Hedestam, R. A. M. Fouchier, S. Phogat, D. R. Burton, J. Sodroski, et al. The challenges of eliciting
neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nature Reviews Microbiology, 6(2):143–155, 2008.
[41] J. A. G. Briggs and H. G. Kräusslich. The molecular architecture of HIV. Journal of Molecular Biology, 410(4):491–
500, 2011.
[42] A. Engelman and P. Cherepanov. The structural biology of HIV-1: mechanistic and therapeutic insights. Nature
Reviews Microbiology, 10(4):279–290, 2012.
[43] A. D. Frankel and J. A. Young. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annual Review of Biochemistry, 67(1):1–25,
1998.
[44] S. Sierra, B. Kupfer, and R. Kaiser. Basics of the virology of HIV-1 and its replication. Journal of Clinical Virology,
34(4):233–244, 2005.
[45] E. O. Freed and M. A. Martin. HIVs and their replication. In Fields Virology, volume 1, chapter 59, pages 1971–2041.
Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 4th edition, 2001.
[46] F. C. Krebs, T. H. Hogan, S. Quiterio, S. Gartner, and B. Wigdahl. Lentiviral LTR-directed expression, sequence variation, and disease pathogenesis. HIV Sequence Compendium. Beschikbaar op http://www.hiv.lanl.gov/content/
sequence/HIV/COMPENDIUM/2001/partI/Wigdahl.pdf, 2001.
[47] Los Alamos National Laboratory. Landmarks of the HIV genome, HXB2. http://www.hiv.lanl.gov/content/
sequence/HIV/MAP/landmark.html, laatst geraadpleegd op 2015-03-12, 1998.
[48] C. Hoffmann, J. K. Rockstroh, and B. S. Kamps. HIV Medicine 2007. Beschikbaar op www.HIVMedicine.com, 2007.
[49] F. Barré-Sinoussi, A. L. Ross, and J. Delfraissy. Past, present and future: 30 years of HIV research. Nature Reviews
Microbiology, 11(12):877–883, 2013.
[50] R. W. Doms and D. Trono. The plasma membrane as a combat zone in the HIV battlefield. Genes and Development,
14(21):2677–2688, 2000.
[51] N. Arhel. Revisiting HIV-1 uncoating. Retrovirology, 7(1):96, 2010.
[52] K. Peng, W. Muranyi, B. Glass, V. Laketa, S. R. Yant, et al. Quantitative microscopy of functional HIV post-entry
complexes reveals association of replication with the viral capsid. eLife, 3:e04114, 2014.
[53] J. A. Levy. HIV and the Pathogenesis of AIDS. American Society for Microbiology, 2007.
[54] J. F. Okulicz, V. C. Marconi, M. L. Landrum, S. Wegner, A. Weintrob, et al. Clinical outcomes of elite controllers,
viremic controllers, and long-term nonprogressors in the US Department of Defense HIV natural history study. The
Journal of Infectious Diseases, 200(11):1714–1723, 2009.
[55] S. G. Deeks and B. D. Walker. Human Immunodeficiency Virus Controllers: Mechanisms of Durable Virus Control
in the Absence of Antiretroviral Therapy. Immunity, 27(3):406–416, 2007.
[56] O. Lambotte, F. Boufassa, Y. Madec, A. Nguyen, C. Goujard, et al. HIV controllers: a homogeneous group of HIV-1
infected patients with a spontaneous control of viral replication. Clinical Infectious Diseases, 41:1053–6, 2005.
[57] P. An and C. A. Winkler. Host genes associated with HIV/AIDS: advances in gene discovery. Trends in Genetics,
26(3):119–131, 2010.
[58] M. Piatak, M. S. Saag, L. C. Yang, S. J. Clark, J. C. Kappes, et al. High levels of HIV-1 in plasma during all stages
of infection determined by competitive PCR. Science, 259(5102):1749–1754, 1993.
[59] T. Schacker, A. C. Collier, J. Hughes, T. Shea, and L. Corey. Clinical and epidemiologic features of primary HIV
infection. Annals of Internal Medicine, 125(4):257–264, 1996.
[60] A. J. McMichael, P. Borrow, G. D. Tomaras, N. Goonetilleke, and B. F. Haynes. The immune response during acute
HIV-1 infection: clues for vaccine development. Nature Reviews Immunology, 10(1):11–23, 2010.
[61] J. Embretson, M. Zupancic, J. L. Ribas, A. Burke, P. Racz, et al. Massive covert infection of helper T lymphocytes
and macrophages by HIV during the incubation period of AIDS. Nature, 362(6418):359–362, 1993.
63
[62] G. Pantaleo, C. Graziosi, J. F. Demarest, L. Butini, M. Montroni, et al. HIV infection is active and progressive in
lymphoid tissue during the clinically latent stage of disease. Nature, 362(6418):355–358, 1993.
[63] D. D. Ho, A. U. Neumann, A. S. Perelson, W. Chen, J. M. Leonard, et al. Rapid turnover of plasma virions and CD4
lymphocytes in HIV-1 infection. Nature, 373(6510):123–126, 1995.
[64] X. Wei, S. K. Ghosh, M. E. Taylor, V. A. Johnson, E. A. Emini, et al. Viral dynamics in human immunodeficiency
virus type 1 infection. Nature, 373(6510):117–122, 1995.
[65] C. C. Bleul, L. Wu, J. A. Hoxie, T. A. Springer, and C. R. Mackay. The HIV coreceptors CXCR4 and CCR5 are
differentially expressed and regulated on human T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, 94(5):1925–1930, 1997.
[66] M. I. Bukrinsky, N. Sharova, M. P. Dempsey, T. L. Stanwick, A. G. Bukrinskaya, et al. Active nuclear import of
human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, 89(14):6580–6584, 1992.
[67] A. Meyerhans, J. P. Vartanian, C. Hultgren, U. Plikat, A. Karlsson, et al. Restriction and enhancement of human
immunodeficiency virus type 1 replication by modulation of intracellular deoxynucleoside triphosphate pools. Journal
of Virology, 68(1):535–540, 1994.
[68] J. D. Lundgren, J. M. Gatell, Furrer H., and Rockstroh J. EACS Guidelines for treatment of HIV-infected adults in
Europe, Version 7.1, November 2014. European AIDS Clinical Society, 2014.
[69] Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV1-infected adults and adolescents. Department of Health and Human Services, Beschikbaar op http://aidsinfo.
nih.gov/ContentFiles/AdultandAdolescentGL.pdf, 2014.
[70] C. R. Rathbun, R. A. Greenfield, M. D. Liedtke, and S. M. Lockhart. Antiretroviral Therapy for HIV Infection.
http://emedicine.medscape.com/article/1533218-overview, laatst geraadpleegd op 2015-03-12, 2014.
[71] The Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral
therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. The Lancet, 372(9635):293–299, 2008.
[72] M. T. May, M. Gompels, V. Delpech, K. Porter, C. Orkin, et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive
individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy: UK cohort study. AIDS (London,
England), 28(8):1193–1202, 2014.
[73] AIDSinfo. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents; Initiating Antiretroviral Therapy in Treatment-Naive Patients. http://aidsinfo.nih.gov/guidelines, laatst geraadpleegd op
2015-07-05, 2014.
[74] NIH. Starting Antiretroviral Treatment Early Improves Outcomes for HIV-Infected Individuals. http://www.niaid.
nih.gov/news/newsreleases/2015/Pages/START.aspx#, laatst geraadpleegd op 2015-05-30, 2015.
[75] J. M. McCune. Viral latency in HIV disease. Cell, 82(2):183–188, 1995.
[76] J. Tanaka, T. Ishida, B. Choi, J. Yasuda, T. Watanabe, et al. Latent HIV-1 reactivation in transgenic mice requires
cell cycle -dependent demethylation of CREB/ATF sites in the LTR. AIDS (London, England), 17(2):167–175, 2003.
[77] D. Finzi, M. Hermankova, T. Pierson, L. M. Carruth, C. Buck, et al. Identification of a Reservoir for HIV-1 in
Patients on Highly Active Antiretroviral Therapy Identification of a Reservoir for HIV-1 in Patients on Highly Active
Antiretroviral Therapy. Science, 278(5341):1295–1300, 1997.
[78] Y. C. Ho, L. Shan, N. N. Hosmane, J. Wang, S. B. Laskey, et al. Replication-competent noninduced proviruses in
the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell, 155(3):540–551, 2013.
[79] M. Stevenson, T. L. Stanwick, M. P. Dempsey, and C. A. Lamonica. HIV-1 replication is controlled at the level of T
cell activation and proviral integration. The EMBO Journal, 9(5):1551–1560, 1990.
[80] J. A. Zack, S. J. Arrigo, S. R. Weitsman, A. S. Go, A. Haislip, et al. HIV-1 entry into quiescent primary lymphocytes:
Molecular analysis reveals a labile, latent viral structure. Cell, 61(2):213–222, 1990.
[81] M. I. Bukrinsky, S. Haggerty, M. P. Dempsey, N. Sharova, A. Adzhubel, et al. A nuclear localization signal within
HIV-1 matrix protein that governs infection of non-dividing cells. Nature, 365(6447):666–669, 1993.
[82] U. von Schwedler, R. S. Kornbluth, and D. Trono. The nuclear localization signal of the matrix protein of human
immunodeficiency virus type 1 allows the establishment of infection in macrophages and quiescent T lymphocytes.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91(15):6992–6996, 1994.
[83] N. K. Heinzinger, M. I. Bukinsky, S. A. Haggerty, A. M. Ragland, V. Kewalramani, et al. The Vpr protein of
human immunodeficiency virus type 1 influences nuclear localization of viral nucleic acids in nondividing host cells.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91(15):7311–7315, 1994.
[84] M. Stevenson, S. Haggerty, C. A. Lamonica, C. M. Meier, S. K. Welch, et al. Integration is not necessary for expression
of human immunodeficiency virus type 1 protein products. Journal of Virology, 64(5):2421–2425, 1990.
[85] M. Bukrinsky, T. Stanwick, M. Dempsey, and M. Stevenson. Quiescent T lymphocytes as an inducible virus reservoir
in HIV-1 infection. Science, 254(5030):423–427, 1991.
[86] T. Pierson, J. McArthur, and R. F. Siliciano. Reservoirs for HIV-1: mechanisms for viral persistence in the presence
of antiviral immune responses and antiretroviral therapy. Annual Review of Immunology, 18(1):665–708, 2000.
[87] A. R. Mclean and C. A. Michie. In vivo estimates of division and death rates of human T lymphocytes. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92(9):3707–3711, 1995.
[88] Y. Zhou, H. Zhang, J. D. Siliciano, and R. F. Siliciano. Kinetics of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Decay
following Entry into Resting CD4+ T Cells. Journal of Virology, 79(4):2199–2210, 2005.
[89] Y. Wu. HIV-1 gene expression: lessons from provirus and non-integrated DNA. Retrovirology, 1(1):13–22, 2004.
[90] M. Coiras, M. López-Huertas, M. Pérez-Olmeda, and J. Alcamı́. Understanding HIV-1 latency provides clues for the
eradication of long-term reservoirs. Nature Reviews Microbiology, 7(11):798–812, 2009.
[91] S. M. Schnittman, M. C. Psallidopoulos, H. C. Lane, L. Thompson, M. Baseler, et al. The reservoir for HIV-1 in
human peripheral blood is a T cell that maintains expression of CD4. Science, 245(4915):305–308, 1989.
[92] K. G. Lassen, J. R. Bailey, and R. F. Siliciano. Analysis of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Transcriptional
Elongation in Resting CD4 T Cells In Vivo. Journal of Virology, 78(17):9105–9114, 2004.
64
[93] K. Lassen, Y. Han, Y. Zhou, J. D. Siliciano, and R. F. Siliciano. The multifactorial nature of HIV-1 latency. Trends
in Molecular Medicine, 10(11):525–531, 2004.
[94] J. D. Siliciano, J. Kajdas, D. Finzi, T. C. Quinn, K. Chadwick, et al. Long-term follow-up studies confirm the stability
of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine, 9(6):727–728, 2003.
[95] O. Niwa and T. Sugahara. 5-Azacytidine induction of mouse endogenous type C virus and suppression of DNA
methylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78(10):6290–6294,
1981.
[96] K. Harbers, A. Schnieke, H. Stuhlmann, D. Jähner, and R. Jaenisch. DNA methylation and gene expression: endogenous retroviral genome becomes infectious after molecular cloning. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, 78(12):7609–7613, 1981.
[97] P. B. Robbins, D. C. Skelton, X. J. Yu, S. Halene, E. H. Leonard, et al. Consistent, persistent expression from
modified retroviral vectors in murine hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, 95(17):10182–10187, 1998.
[98] T. Koiwa, A. Hamano-Usami, T. Ishida, A. Okayama, K. Yamaguchi, et al. Methylation of Latent Human T-Cell
Leukemia Virus Type 1 Provirus In Vitro and In Vivo 5-Long Terminal Repeat-Selective CpG Methylation of Latent
Human T-Cell Leukemia Virus Type 1 Provirus In Vitro and In Vivo. Journal of Virology, 76(18):9389–9397, 2002.
[99] L. Lavie, M. Kitova, E. Maldener, E. Meese, and J. Mayer. CpG methylation directly regulates transcriptional activity
of the human endogenous retrovirus family HERV-K (HML-2). Journal of Virology, 79(2):876–883, 2005.
[100] Y. Taniguchi, K. Nosaka, J. Yasunaga, M. Maeda, N. Mueller, et al. Silencing of human T-cell leukemia virus type I
gene transcription by epigenetic mechanisms. Retrovirology, 2(1):64–79, 2005.
[101] K. Schulze-Forster, F. Götz, H. Wagner, H. Kröger, and D. Simon. Transcription of HIV1 is inhibited by DNA
methylation. Biochemical and Biophysical Research Communications, 168(1):141–147, 1990.
[102] J. Fang, J. A. Mikovits, R. Bagni, L. Cari, F. W. Ruscetti, et al. Infection of Lymphoid Cells by Immunodeficiency Virus Type 1 Increases De Novo Methylation Infection of Lymphoid Cells by Integration-Defective Human
Immunodeficiency Virus Type 1 Increases De Novo Methylation. Journal of Virology, 75(20):9753–9761, 2001.
[103] J. Hejnar, E. Verdin, and I. Hirsch. Transcriptional Suppression of In Vitro-Integrated Human Immunode ciency
Virus Type 1 Does Not Correlate with Proviral DNA Methylation. Journal of Virology, 77(7):4025–4032, 2003.
[104] T. Ishida, A. Hamano, T. Koiwa, and T. Watanabe. 5’ long terminal repeat (LTR)-selective methylation of latently
infected HIV-1 provirus that is demethylated by reactivation signals. Retrovirology, 3(1):69–75, 2006.
[105] H. Mok and A. M. Lever. Chromatin, gene silencing and HIV latency. Genome Biology, 8(11):228–236, 2007.
[106] R. E. Jeeninga, E. M. Westerhout, M. L. van Gerven, and B. Berkhout. HIV-1 latency in actively dividing human T
cell lines. Retrovirology, 5(37):7–19, 2008.
[107] J. Blazkova, K. Trejbalova, F. Gondois-Rey, P. Halfon, P. Philibert, et al. CpG methylation controls reactivation of
HIV from latency. PLoS Pathogens, 5(8):e1000554, 2009.
[108] S. E. Kauder, A. Bosque, A. Lindqvist, V. Planelles, and E. Verdin. Epigenetic regulation of HIV-1 latency by
cytosine methylation. PLoS Pathogens, 5(6):e1000495, 2009.
[109] L. Chávez, S. Kauder, and E. Verdin. In vivo, in vitro, and in silico analysis of methylation of the HIV-1 provirus.
Methods, 53(1):47–53, 2011.
[110] S. Weber, B. Weiser, K. S. Kemal, H. Burger, C. M. Ramirez, et al. Epigenetic analysis of HIV-1 proviral genomes
from infected individuals: predominance of unmethylated CpG’s. Virology, 449:181–189, 2014.
[111] J. Blazkova, D. Murray, and J. S. Justement. Paucity of HIV DNA methylation in latently infected, resting CD4+
T cells from infected individuals receiving antiretroviral therapy. Journal of Virology, 86(9):5390–5392, 2012.
[112] J. A. Palacios, T. Pérez-Piñar, C. Toro, B. Sanz-Minguela, V. Moreno, et al. Long-term nonprogressor and elite
controller patients who control viremia have a higher percentage of methylation in their HIV-1 proviral promoters
than aviremic patients receiving highly active antiretroviral therapy. Journal of Virology, 86(23):13081–13084, 2012.
[113] K. Suzuki, T. Shijuuku, T. Fukamachi, J. Zaunders, G. Guillemin, et al. Prolonged transcriptional silencing and
CpG methylation induced by siRNAs targeted to the HIV-1 promoter region. Journal of RNAi and Gene Silencing,
1(2):66–78, 2005.
[114] R. Van Duyne, R. Easley, W. Wu, R. Berro, and C. Pedati et al. Lysine methylation of HIV-1 Tat regulates
transcriptional activity of the viral LTR. Retrovirology, 5(1):40–52, 2008.
[115] A. Duverger, J. Jones, J. May, F. Bibollet-Ruche, F. A. Wagner, et al. Determinants of the establishment of human
immunodeficiency virus type 1 latency. Journal of Virology, 83(7):3078–3093, 2009.
[116] J. Friedman, W. Cho, C. K. Chu, K. S. Keedy, N. M. Archin, et al. Epigenetic Silencing of HIV-1 by the Histone H3
Lysine 27 Methyltransferase Enhancer of Zeste 2. Journal of Virology, 85(17):9078–9089, 2011.
[117] G. He and D. M. Margolis. Counterregulation of chromatin deacetylation and histone deacetylase occupancy at
the integrated promoter of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) by the HIV-1 repressor YY1 and HIV-1
activator Tat. Molecular and Cellular Biology, 22(9):2965–2973, 2002.
[118] G. He, L. Ylisastigui, and D. M. Margolis. The regulation of HIV-1 gene expression: the emerging role of chromatin.
DNA and Cell Biology, 21(10):697–705, 2002.
[119] J. J. Coull, F. Romerio, J. M. Sun, J. L. Volker, K. M. Galvin, et al. The human factors YY1 and LSF repress
the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat via recruitment of histone deacetylase 1. Journal of
Virology, 74(15):6790–6799, 2000.
[120] I. du Chéné, E. Basyuk, Y. Lin, R. Triboulet, A. Knezevich, et al. Suv39H1 and HP1gamma are responsible for
chromatin-mediated HIV-1 transcriptional silencing and post-integration latency. The EMBO Journal, 26(2):424–
435, 2007.
[121] B. J. Winslow, R. J. Pomerantz, O. Bagasra, and D. Trono. HIV-1 latency due to the site of proviral integration.
Virology, 196(2):849–854, 1993.
[122] A. Jordan, D. Bisgrove, and E. Verdin. HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells
in vitro. The EMBO Journal, 22(8):1868–1877, 2003.
65
[123] G. Nabel and D. Baltimore. An inducible transcription factor activates expression of human immunodeficiency virus
in T cells. Nature, 326(6114):711–713, 1987.
[124] S. E. Tong-Starksen, P. A. Luciw, and B. M. Peterlin. Human immunodeficiency virus long terminal repeat responds
to T-cell activation signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
84(19):6845–6849, 1987.
[125] E. Böhnlein, J. W. Lowenthal, M. Siekevitz, D. W. Ballard, B. R. Franza, et al. The same inducible nuclear proteins
regulates mitogen activation of both the interleukin-2 receptor-alpha gene and type 1 HIV. Cell, 53(5):827–836, 1988.
[126] E. J. Duh, W. J. Maury, T. M. Folks, A. S. Fauci, and A. B. Rabson. Tumor necrosis factor alpha activates human
immunodeficiency virus type 1 through induction of nuclear factor binding to the NF-kappa B sites in the long terminal
repeat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86(15):5974–5978, 1989.
[127] J. Cohen. Understanding HIV latency to undo it. Science, 332(6031):786, 2011.
[128] L. M. Mansky and H. M. Temin. Lower in vivo mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 than that
predicted from the fidelity of purified reverse transcriptase. Journal of Virology, 69(8):5087–5094, 1995.
[129] A. S. Perelson, A. U. Neumann, M. Markowitz, J. M. Leonard, and D. D. Ho. HIV-1 Dynamics in Vivo: Virion
Clearance Rate, Infected Cell Life-Span, and Viral Generation Time. Science, 271(5255):1582–1586, 1996.
[130] D. L. Robertson, P. M. Sharp, F. E. McCutchan, and B. H. Hahn. Recombination in HIV-1. Nature, 374(6518):124–
126, 1995.
[131] E. Domingo and J. J. Holland. RNA virus mutations and fitness for survival. Annual Review of Microbiology,
51(1):151–178, 1997.
[132] T. Shors. Understanding Viruses. Jones and Bartlett Learning, 2nd edition, 2011.
[133] M. M. Thomson, L. Pérez-Álvarez, and R. Nájera. Molecular epidemiology of HIV-1 genetic forms and its significance
for vaccine development and therapy. The Lancet, 2(8):461–471, 2002.
[134] T. L. Kieffer, M. M. Finucane, R. E. Nettles, T. C. Quinn, K. W. Broman, et al. Genotypic analysis of HIV-1 drug
resistance at the limit of detection: virus production without evolution in treated adults with undetectable HIV loads.
The Journal of Infectious Diseases, 189(8):1452–1465, 2004.
[135] R. W. Shafer, S. Rhee, D. Pillay, V. Miller, P. Sandstrom, et al. HIV-1 protease and reverse transcriptase mutations
for drug resistance surveillance. AIDS (London, England), 21(2):215–223, 2007.
[136] C. H. Waddington. The epigenotype. Endeavour, pages 18–20, 1942.
[137] C. H. Waddington. Towards a theoretical biology. Nature, 218(5141):525–527, 1968.
[138] R. Holliday. Mechanisms For The Control Of Gene Activity During Development. Biological Reviews, 65(4):431–471,
1990.
[139] A. D. Goldberg, C. D. Allis, and E. Bernstein. Epigenetics: A Landscape Takes Shape. Cell, 128(4):635–638, 2007.
[140] S. Finer, M. L. Holland, L. Nanty, and V. K. Rakyan. The Hunt for the Epiallele. Environmental and Molecular
Mutagenesis, 51:1–11, 2011.
[141] W. Reik. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature, 447(7143):425–
432, 2007.
[142] R. D. Kornberg. Structure of chromatin. Annual Review of Biochemistry, 46(1):931–954, 1977.
[143] J. D. McGhee and G. Felsenfeld. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry, 49(1):1115–1156, 1980.
[144] K. Luger, A. W. Mäder, R. K. Richmond, D. F. Sargent, and T. J. Richmond. Crystal structure of the nucleosome
core particle at 2.8 A resolution. Nature, 389(6648):251–260, 1997.
[145] N. Huck-Hui and A. Bird. DNA methylation and chromatin modification. Current Opinion in Genetics and Development, 9(2):158–163, 1999.
[146] D. M. Knipe and A. Cliffe. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nature Reviews
Microbiology, 6(3):211–221, 2008.
[147] B. Li, M. Carey, and J. L. Workman. The Role of Chromatin during Transcription. Cell, 128(4):707–719, 2007.
[148] A. H. F. M. Peters, J. E. Mermoud, D. O’Carroll, M. Pagani, D. Schweizer, et al. Histone H3 lysine 9 methylation
is an epigenetic imprint of facultative heterochromatin. Nature Genetics, 30(1):77–80, 2002.
[149] J. A. Law and S. E. Jacobsen. Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and
animals. Nature Reviews Genetics, 11(3):204–220, 2010.
[150] R. Feil and M. F. Fraga. Epigenetics and the environment: emerging patterns and implications. Nature Reviews
Genetics, 13(2):97–109, 2012.
[151] V. Colot and J. L. Rossignol. Eukaryotic dna methylation as an evolutionary device. Bioessays, 21(5):402–411, 1999.
[152] M. Okano, D. W. Bell, D. A. Haber, and E. Li. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de
novo methylation and mammalian development. Cell, 99(3):247–257, 1999.
[153] S. Pradhan, A. Bacolla, R. D. Wells, and R. J. Roberts. Recombinant Human DNA (Cytosine-5) Methyltransferase.
Journal of Biological Chemistry, 274(46):33002 –33010, 1999.
[154] J. T. Attwood, R. L. Yung, and B. C. Richardson. DNA methylation and the regulation of gene transcription. Cellular
and Molecular Life Sciences, 59(2):241–257, 2002.
[155] S. U. Kass, N. Landsberger, and A. P. Wolffe. DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription
initiation. Current Biology, 7(3):157–165, 1997.
[156] Z. Siegfried, S. Eden, M. Mendelsohn, X. Feng, B. Z. Tsuberi, et al. DNA methylation represses transcription in vivo.
Nature Genetics, 22(2):203–206, 1999.
[157] H. Cedar and Y. Bergman. Linking DNA methylation and histone modification: patterns and paradigms. Nature
Reviews Genetics, 10(5):295–304, 2009.
[158] P. A. Jones. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond. Nature Reviews Genetics,
13(7):484–492, 2012.
[159] A. K. Maunakea, R. P. Nagarajan, M. Bilenky, T. J. Ballinger, C. D’Souza, et al. Conserved role of intragenic DNA
methylation in regulating alternative promoters. Nature, 466(7303):253–257, 2010.
[160] S. K. T. Ooi and T. H. Bestor. Cytosine Methylation: Remaining Faithful. Current Biology, 18(4):174–176, 2008.
66
[161] A. P. Bird. DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA. Nucleic Acids Research, 8(7):1499–1504,
1980.
[162] C. Burge, A. M. Campbell, and S. Karlin. Over- and under-representation of short oligonucleotides in DNA sequences.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89(4):1358–1362, 1992.
[163] F. Antequera. Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cellular and Molecular Life Sciences,
60(8):1647–1658, 2003.
[164] P. Caiafa and M. Zampieri. DNA methylation and chromatin structure: The puzzling CpG islands. Journal of
Cellular Biochemistry, 94(2):257–265, 2005.
[165] M. Gardiner-Garden and M. Frommer. CpG islands in vertebrate genomes. Journal of Molecular Biology, 196(2):261–
282, 1987.
[166] A. B. Brinkman, F. Simmer, K. Ma, A. Kaan, J. Zhu, et al. Whole-genome DNA methylation profiling using
MethylCap-seq. Methods, 52(3):232–236, 2010.
[167] N. Li, M. Ye, Y. Li, Z. Yan, L. M. Butcher, et al. Whole genome DNA methylation analysis based on high throughput
sequencing technology. Methods, 52(3):203–212, 2010.
[168] D. Serre, B. H. Lee, and A. H. Ting. MBD-isolated genome sequencing provides a high-throughput and comprehensive
survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Research, 38(2):391–399, 2009.
[169] H. Hayatsu, Y. Wataya, K. Kai, and S. Iida. Reaction of sodium bisulfite with uracil, cytosine, and their derivatives.
Biochemistry, 9(14):2858–2865, 1970.
[170] R. Shapiro, R. E. Servis, and M. Welcher. Reactions of Uracil and Cytosine Derivatives with Sodium Bisulfite.
Journal of the American Chemical Society, 92(2):422–424, 1970.
[171] R. Shapiro, B. Braverman, J. B. Louis, and R. E. Servis. Nucleic Acid Reactivity and Conformation. Journal of
Biological Chemistry, 248(11):4060–4064, 1973.
[172] R. Y. H. Wang, C. W. Gehrke, and M. Ehrlich. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and
deoxycytidine residues. Nucleic Acids Research, 8(20):4777–4790, 1980.
[173] M. Frommer, L. E. McDonald, D. S. Millar, C. M. Collis, F. Watt, et al. A genomic sequencing protocol that yields
a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 89(5):1827–1831, 1992.
[174] H. Hayatsu and M. Shiragami. Reaction of bisulfite with the 5-hydroxymethyl group in pyrimidines and in phage
DNAs. Biochemistry, 18(4):632–637, 1979.
[175] S. J. Clark, J. Harrison, C. L. Paul, and M. Frommer. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic
Acids Research, 22(15):2990–2997, 1994.
[176] R. P. Darst, C. E. Pardo, L. Ai, K. D. Brown, and M. P. Kladde. Bisulfite sequencing of DNA. Current Protocols in
Molecular Biology, pages Chapter: unit–7.917, 2010.
[177] A. Meissner, A. Gnirke, G. W. Bell, B. Ramsahoye, E. S. Lander, et al. Reduced representation bisulfite sequencing
for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research, 33(18):5868–5877, 2005.
[178] J. G. Herman, J. R. Graff, S. Myöhänen, B. D. Nelkin, and S. B. Baylin. Methylation-specific PCR: a novel PCR
assay for methylation status of CpG islands. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America, 93(18):9821–9826, 1996.
[179] D. Y. M. Lo, I. H. N. Wong, J. Zhang, M. S. C. Tein, M. H. L. Ng, et al. Quantitative Analysis of Aberrant
p16 Methylation Using Real-Time Quantitative Methylation-specific Polymerase Chain Reaction Advances in Brief
Quantitative Analysis of Aberrant p16 Methylation Using Real-Time Quantitative. Cancer Research, 59(16):3899–
3903, 1999.
[180] E. J. Lee, J. Luo, J. M. Wilson, and H. Shi. Analyzing the cancer methylome through targeted bisulfite sequencing.
Cancer Letters, 340(2):171–178, 2013.
[181] P. M. Warnecke, C. Stirzaker, J. R. Melki, D. S. Millar, C. L. Paul, et al. Detection and measurement of PCR bias
in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA. Nucleic Acids Research, 25(21):4422–4426, 1997.
[182] E. A. Moskalev, M. G. Zavgorodnij, S. P. Majorova, I. A. Vorobjev, P. Jandaghi, et al. Correction of PCR-bias in
quantitative DNA methylation studies by means of cubic polynomial regression. Nucleic Acids Research, 39:1–12,
2011.
[183] R. Jaenisch, A. Schnieke, and K. Harbers. Treatment of mice with 5-azacytidine efficiently activates silent retroviral
genomes in different tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
82(5):1451–1455, 1985.
[184] T. H. Bestor. DNA methylation: evolution of a bacterial immune function into a regulator of gene expression
and genome structure in higher eukaryotes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B,
Biological Sciences, 326(1235):179–187, 1990.
[185] H. Stuhlmann, D. Jähner, and R. Jaenisch. Infectivity and methylation of retroviral genomes is correlated with
expression in the animal. Cell, 26(2):221–232, 1981.
[186] J. K. Christman, N. Weich, B. Schoenbrun, N. Schneiderman, and G. Acs. Hypomethylation of DNA during differentiation of Friend erythroleukemia cells. The Journal of Cell Biology, 86(2):366–370, 1980.
[187] N. Hochstein, I. Muiznieks, L. Mangel, H. Brondke, and W. Doerfler. Epigenetic status of an adenovirus type 12
transgenome upon long-term cultivation in hamster cells. Journal of Virology, 81(10):5349–5361, 2007.
[188] M. Kalantari, L. L. Villa, I. E. Calleja-Macias, and H. U. Bernard. Human papillomavirus-16 and -18 in penile
carcinomas: DNA methylation, chromosomal recombination and genomic variation. International Journal of Cancer,
123(8):1832–1840, 2008.
[189] R. C. Desrosiers, C. Mulder, and B. Fleckenstein. Methylation of Herpesvirus saimiri DNA in lymphoid tumor cell
lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76(8):3839–3843, 1979.
[190] M. Takacs, F. Banati, A. Koroknai, J. Segesdi, D. Salamon, et al. Epigenetic regulation of latent Epstein-Barr virus
promoters. Biochimica et Biophysica Acta, 1799(3-4):228–235, 2009.
67
[191] D. Sutter and W. Doerfler. Methylation of integrated adenovirus type 12 DNA sequences in transformed cells is
inversely correlated with viral gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America, 77(1):253–256, 1980.
[192] E. Verdin, P. Paras, and C. Van Lint. Chromatin disruption in the promoter of human immunodeficiency virus type
1 during transcriptional activation. The EMBO Journal, 12(8):3249–3259, 1993.
[193] A. El Kharroubi and E. Verdin. Protein-DNA interactions within DNase I-hypersensitive sites located downstream
of the HIV-1 promoter. Journal of Biological Chemistry, 269(31):19916–19924, 1994.
[194] R. Miller. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science,
239(4846):1420–1422, 1988.
[195] S. Karlin, W. Doerfler, and L. R. Cardon. Why is CpG suppressed in the genomes of virtually all small eukaryotic
viruses but not in those of large eukaryotic viruses? Journal of Virology, 68(5):2889–2897, 1994.
[196] C. Van Lint, S. Emiliani, M. Ott, and E. Verdin. Transcriptional activation and chromatin remodeling of the HIV-1
promoter in response to histone acetylation. The EMBO Journal, 15(5):1112–1120, 1996.
[197] M. E. Gerritsen, A. J. Williams, A. S. Neish, S. Moore, Y. Shi, et al. CREB-binding protein/p300 are transcriptional
coactivators of p65. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94(7):2927–
2932, 1997.
[198] C. Tréand, I. du Chéné, V. Brès, R. Kiernan, R. Benarous, et al. Requirement for SWI/SNF chromatin-remodeling
complex in Tat-mediated activation of the HIV-1 promoter. The EMBO Journal, 25(8):1690–1699, 2006.
[199] T. Mahmoudi, M. Parra, R. G. J. Vries, S. E. Kauder, C. P. Verrijzer, et al. The SWI/SNF chromatin-remodeling
complex is a cofactor for Tat transactivation of the HIV promoter. Journal of Biological Chemistry, 281(29):19960–
19968, 2006.
[200] S. Lefever, F. Pattyn, J. Hellemans, and J. Vandesompele. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches
reduce performance of quantitative PCR assays. Clinical Chemistry, 59(10):1470–1480, 2013.
[201] L. Li and R. Dahiya. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics (Oxford, England),
18(11):1427–1431, 2002.
[202] W. A. Kibbe. OligoCalc: An online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research, 35(Suppl 2):43–46,
2007.
[203] A. Bosque and V. Planelles. Induction of HIV-1 latency and reactivation in primary memory CD4+ T cells. Blood,
113(1):58–65, 2009.
[204] A. Bosque and V. Planelles. Studies of HIV-1 latency in an ex vivo model that uses primary central memory T cells.
Methods (San Diego, Calif.), 53(1):54–61, 2011.
[205] P. Bonczkowski, W. De Spiegelaere, A. Bosque, C. H. White, A. Van Nuffel, et al. Replication competent virus as
an important source of bias in HIV latency models utilizing single round viral constructs. Retrovirology, 11(1):70–73,
2014.
[206] C. M. Hindson, J. R. Chevillet, H. A. Briggs, E. N. Gallichotte, I. K. Ruf, et al. Absolute quantification by droplet
digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods, 10(10):1003–1005, 2013.
[207] Bio-Rad. Droplet DigitalTM PCR Applications Guide. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/
Bulletin_6407.pdf, laatst geraadpleegd op 2015-04-26, 2015.
[208] Illumina. Data Sheet: Sequencing; TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit. http://www.illumina.com/
content/dam/illumina-marketing/documents/products/datasheets/datasheet_truseq_dna_pcr_free_sample_
prep.pdf, laatst geraadpleegd op 2015-05-31.
[209] F. Krueger and S. R. Andrews. Bismark: A flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.
Bioinformatics, 27(11):1571–1572, 2011.
[210] E. E. Holmes, M. Jung, S. Meller, A. Leisse, V. Sailer, et al. Performance evaluation of kits for bisulfite-conversion
of DNA from tissues, cell lines, FFPE tissues, aspirates, lavages, effusions, plasma, serum, and urine. PloS one,
9(4):e93933, 2014.
[211] Illumina.
Technology Spotlight: Illumina®
Sequencing.
http://www.illumina.com/documents/products/
techspotlights/techspotlight_sequencing.pdf, laatst geraadpleegd op 2015-05-31.
68
Addenda
Figuur A1: De 3’-adenylatie van de DNA-fragmenten als voorbereiding voor de sequencing
[208].
Figuur A2: Enkelstrengige DNA-fragmenten worden ad random gehybridiseerd aan de oligo’s
die zich op de flow cell bevinden [211].
69
70
Figuur A3: Het uiteinde van de ssDNA-streng is complementair met de tweede oligo, en er
zal na hybridisatie een ssDNA brug gevormd. DNA-polymerase zal deze streng dubbelstrengig
maken [211].
Figuur A4: DNA-polymerase enzymen hebben de ssDNA-brug omgezet naar een dsDNAbrug [211].
71
Figuur A5: De dsDNA-brug denatureert, waardoor er twee complementaire ssDNA-strengen
gevormd worden. [211].
Figuur A6: Door simultane amplificatie van de input fragmenten, worden er miljoenen clusters
gevormd op de flow cell [211].
72
Figuur A7: De dNTP-reversible terminator complexen, primers, en DNA-polymerase wordt
toegevoegd. De DNTP’s van de complexen binden aan de complementaire streng, en de reversible
terminators worden geëxciteerd met een laser [211].
Figuur A8: Na de laser-excitatie wordt de uitgezonden fluorescentie van elke cluster gedetecteerd, en wordt de base geı̈dentificeerd [211].
73
Figuur A9: De sequencing cycli worden herhaald tot als de volledige streng is gesynthetiseerd
en base per base is gesequeneerd [211].
74
Tabel A1: Gebruikte primerparen voor de sequencing van de SupT1-cellijnen.
Naam
Locatie
sense
streng
Sequentie
LTR2 f
LTR2 r
572→597
887←910
TGTGTGATTTTGGTAATTAGAGATTT
ACTCCCTACTTACCCATACTATAT
338 bp
LTR13 fa
LTR13 ra
228→249
880←909
ATGGATGATTTTGAGAGAGAAG
CTCCCTACTTACCCATACTATATATTTTAA
681 bp
LTR4 f
LTR4 r
569→595
888←914
TGTTGTGTGATTTTGGTAATTAGAGAT
TCTAACTCCCTACTTACCCATACTATA
345 bp
LTR6 fa
LTR6 ra
228→249
485←506
ATGGATGATTTTGAGAGAGAAG
CCTAATTAACCAAAAAACTCCC
278 bp
LTR7 fa
LTR7 ra
617→638
854←874
TGTGGAAAATTTTTAGTAGTGG
ATTATTTCTTTCCCCCTAACC
257 bp
LTR11 fa
LTR11 r
228→249
887←910
ATGGATGATTTTGAGAGAGAAG
ACTCCCTACTTACCCATACTATAT
682 bp
LTR14 fa
LTR14 ra
228→249
854←874
ATGGATGATTTTGAGAGAGAAG
ATTATTTCTTTCCCCCTAACC
646 bp
LTR21 fc
LTR21 rc
161→191
589←609
AGAGAAGGTAGAAGAAGTTAATGAAGGAGA
AAATCTAAAAAATCTCTAATTACCAAAATC
448 bp
LTR28 fd
LTR28 rd
170→200
449←479
AGAAGAGGTTAATAAAGGAGAGAATATTAG
CAAATCTAATCTAACCAAAAAAACCCAATA
309 bp
LTR32 fb
LTR32 rb
659→678
804←824
AAGCGAAAGGGAAACCAGAG
TCTCCCCCGCTTAATACTGA
166 bp
AS2-1 f
AS2-1 r
790←818
343→372
TCGTTTAATATTGACGTTTTCGTATTTAT
ACTACAAAAAACTTTCCGCTAAAAACTTTC
475 bp
AS2-3 f
AS2-1 r
790←818
457→486
TCGTTTAATATTGACGTTTTCGTATTTAT
TCTCTCTAATTAAACCAAATCTAAACCTAA
361 bp
AS7 f
AS7 r
695←717
496→525
TGCGCGTTTTAGTAAGTCGAGTT
AACTAACTAAAAAACCCACTACTTAAACCT
221 bp
AS9 f
AS9 r
684←706
509→538
GTAAGTCGAGTTTTGCGTCGAGA
ACCCACTACTTAAACCTCAATAAAACTTAC
197 bp
Ampliconlengte
f: forward primer; r: reverse primer; a verkregen via Alberto Bosque, Ph.D, University of Utah School of Medicine; b [108]; c [107]; c [110]
Locatie
LTR2.1
HXB2
238
273
290
297
310
336
359
360
381
382
392
393
408
409
565
566
639
61
640
643
61
644
661
62
662
687
61
688
690
62
691
699
64
700
712
64
713
714
64
715
718
64
719
728
64
729
735
64
736
738
64
739
751
64
752
770
64
771
797
61
798
803
62
804
816
62
817
832
847
62
* data geëxcludeerd
LTR2.3
132
130
130
129
130
130
133
134
134
136
136
136
136
132
130
130
130
128
LTR2.2
803
807
804
806
808
810
809
814
816
810
811
812
812
804
780
780
776
759
40
41
42
11
148
145
142
35
39
40
43
43
40
40
32
32
30
25
25
25
21
20
20
25
28
15
15
15
15
15
15
13
13
14
12
12
12
12
13
13
13
15
15
33
39
27
40
41
43
41
130
143
125
150
153
152
153
29
LTR13.2
LTR13.1
342
*9
574
354
356
368
370
364
364
364
358
358
358
356
354
354
338
338
338
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
LTR7
346
8672
8659
8702
8520
8723
8730
8751
8752
8730
8725
LTR6
585
593
590
610
632
634
634
632
640
644
640
638
633
633
625
626
625
LTR4
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
LTR11
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
12
14
14
18
18
19
20
20
20
18
LTR14
479
965
966
966
506
962
951
939
496
499
LTR21
9869
9873
9881
9797
9927
9914
9937
9937
9919
9902
LTR28
11025
11054
11062
11080
11079
11065
11080
11080
11073
11058
11074
11076
11059
11021
11034
LTR32
*142
*172
*177
*178
186
187
187
189
190
190
189
190
190
190
188
208
349
371
*192
*192
*192
*188
AS2-1
*104
*132
*137
*140
271
283
284
283
281
284
285
288
290
290
294
298
298
296
AS2-3
*6
*6
*6
*6
6
6
6
6
6
6
6
AS7
Tabel A2: Coverage van de C-residu’s in de SupT1 cellijnen die een primaire, actieve infectie (90-100%) met het NL4.3-virus ondergingen.
222
222
222
230
230
232
234
AS9
75
76
42
42
36
1220
36
1228
28
1228
26
1226
26
1228
24
1228
24
1228
24
1229
24
1230
24
1230
24
1230
22
1228
16
1225
16
1226
16
1222
16
Staal1
94
90
78
7457
68
7500
50
7499
50
7508
52
7506
52
7507
52
7509
50
7509
50
7512
50
7513
50
7513
50
7499
28
7468
28
7469
28
7437
27
Staal2
15691
8
15807
8
15813
8
15828
6
15840
6
15774
6
15842
6
15835
6
15842
6
15833
6
15843
8
15831
8
15760
8
15754
8
15593
8
Staal3
26
26
24
11969
36
12043
30
12047
30
12047
24
12047
24
12044
24
12039
24
12038
24
12034
24
12025
24
12037
26
12035
18
12014
18
12005
17
11939
17
Staal4
22
22
24
11829
26
11876
24
11876
24
11884
22
11878
22
11880
21
11884
22
11881
20
11882
20
11857
20
11875
19
11872
13
11862
13
11859
13
11817
11
Staal5
46
46
46
8680
40
8739
24
8742
22
8740
20
8741
20
8738
20
8740
20
8737
18
8738
18
8737
18
8733
18
8724
11
8712
10
8702
10
8676
8
Staal6
12
14
12
10793
10
10845
10
10852
10
10858
10
10862
8
10864
8
10861
8
10864
8
10860
8
10822
8
10851
8
10843
6
10841
Staal7
Staal8
25
26
20
10597
22
10641
16
10647
16
10651
16
10653
12
10648
12
10657
12
10655
12
10656
12
10634
12
10645
12
10656
6
10634
6
10636
6
10593
6
Staal9
34
32
30
6372
30
6406
26
6404
26
6410
18
6409
18
6410
18
6407
18
6407
20
6406
20
6408
19
6407
20
6398
14
6398
14
6396
14
6384
14
Staal10
42
42
34
8049
32
8093
18
8097
18
8098
18
8103
18
8102
18
8101
18
8101
20
8104
19
8073
20
8089
20
8079
14
8064
14
8057
14
8009
14
Staal11
22
24
20
9438
22
9523
22
9531
22
9532
18
9538
18
9535
18
9532
18
9535
20
9534
20
9527
20
9537
20
9517
14
9476
14
9480
14
9459
13
Staal12
10793
10828
16
16
14
9676
14
9724
10
9725
10
9727
12
9730
12
9727
12
9724
12
9722
12
9724
14
9720
14
9718
14
9707
9
9707
9
9604
9
9662
8
Tabel A3: Coverage van de C-residu’s in de stalen van het latentiemodel. Staal1-6 zijn de gereactiveerde CD4+ T-cellen, Staal7-12 zijn de
niet-gereactiveerde CD4- T-cellen.
Locatie
HXB2
566
640
644
661
662
687
688
690
691
699
700
712
713
714
715
718
719
728
729
735
736
738
739
751
752
770
771
797
798
803
804
816
817
77
Figuur A10: Heatmap van de methylatie in de cellen van het latentiemodel; sense en antisense streng. Voor elke locatie van een CpG in HXB2 binnen de gesequeneerde regio is het
methylatiepercentage weergegeven. Voor de witte vakjes waren er geen data beschikbaar. Links
van de zwarte lijn zijn de gereactiveerde CD4+ T-cellen; rechts van de zwarte lijn zijn de nietgereactiveerde CD4- T-cellen.
78
Tabel A4: Differentiële methylatie per C-residu tussen de gereactiveerde CD4+ T-cellen en de
niet-gereactiveerde CD4- T-cellen; sense en antisense streng. De vetgedrukte locaties vertonen
significante verschillen op het 5% significantieniveau.
Locatie
HXB2
566
640
644
661
662
687
688
690
691
699
700
712
713
714
715
718
719
728
729
735
736
738
739
751
752
770
771
797
798
803
804
816
817
p
q
1.00E+00
1.00E+00
1.16E-01
4.02E-01
5.47E-01
0.00E+00
4.41E-01
5.31E-03
5.49E-01
1.06E-02
4.40E-02
3.49E-04
1.75E-01
4.28E-11
1.68E-01
1.12E-04
1.27E-01
1.04E-11
4.04E-01
1.13E-12
4.01E-01
2.59E-13
5.45E-01
0.00E+00
3.05E-01
6.58E-01
5.82E-02
1.05E-01
1.00E+00
3.11E-05
1.00E+00
1.80E-03
3.21E-01
1.00E+00
1.00E+00
2.39E-01
5.56E-01
6.47E-01
0.00E+00
5.83E-01
1.59E-02
6.47E-01
2.92E-02
1.12E-01
1.28E-03
3.04E-01
2.35E-10
3.04E-01
4.63E-04
2.47E-01
6.84E-11
5.56E-01
9.34E-12
5.56E-01
2.85E-12
6.47E-01
0.00E+00
5.03E-01
7.49E-01
1.37E-01
2.32E-01
1.00E+00
1.47E-04
1.00E+00
5.93E-03
5.05E-01
Differentiële
methylatie (%)
0.000
0.000
-3.462
0.011
-2.344
-2.468
-3.934
-0.816
-3.162
-0.748
-10.043
-1.049
-6.804
-1.790
-6.937
-0.098
-7.757
-1.845
-4.440
-1.930
-3.998
-1.987
-2.923
-1.849
-5.051
-0.129
-12.850
0.043
0.000
-0.087
0.000
0.021
1.149
Locatie
HXB2
566
639
640
643
644
661
662
687
688
690
691
699
700
712
713
714
715
718
719
728
729
735
736
738
739
751
752
770
771
797
798
803
804
816
817
7475
8
7568
8
7572
8
7578
6
7594
6
7590
6
7590
6
7595
10
7590
12
7588
12
7578
14
7545
14
7466
14
7418
14
7240
14
05085
12707
6
12697
6
12624
6
12576
6
12425
6
12716
12718
12721
12724
12724
12717
12698
12690
12676
14
11445
24
11592
24
11598
24
11610
24
11617
24
11613
24
11612
24
11615
26
11622
26
11619
26
11615
26
11603
21
11553
20
11529
20
11456
20
24
9323
28
9443
24
9457
24
9469
24
9478
24
9483
24
9485
26
9492
28
9494
28
9390
28
9481
30
9471
27
9422
25
9403
25
9325
23
12512
14
24
05087
16
05086
28
05080
17101
14
17376
14
17387
14
17392
14
17411
12
17420
12
17431
12
17430
12
17444
12
17448
12
17423
14
17376
14
17246
16
17189
16
16918
16
05100
9741
9766
9774
12
9749
16
9798
12
9802
12
9806
8
9810
8
9802
8
9812
6
9813
6
9814
6
9812
6
9813
6
9808
14
12
08055
13344
6
13347
6
13340
8
13296
10
13179
10
13148
10
12988
10
13343
13345
13342
13342
13322
13302
13286
13144
96040
12824
22
12886
24
12896
24
12902
24
12904
22
12898
22
12903
22
12903
22
12911
22
12776
22
12911
22
12906
22
12803
22
12848
22
12803
22
05040
8
449
10
450
8
5532
8
5610
8
5616
8
5624
10
5621
12
5627
12
5632
10
5629
10
5630
10
5630
10
5632
12
5609
12
5569
12
5541
12
5486
12
08077
18
8188
20
8255
20
8266
20
8269
18
8270
19
8265
20
8274
20
8277
20
8277
20
8270
20
8271
20
8234
16
8207
16
8196
16
8147
14
20
20
09063
10563
12
10752
12
10762
12
10786
12
10806
12
10807
12
10815
12
10819
12
10816
12
10816
12
10811
14
10794
14
10674
16
10611
16
10428
16
10010
34
10639
42
10775
36
10778
36
10808
38
10820
38
10813
36
10820
34
10821
36
10821
36
10822
34
10817
32
10818
26
10775
24
10752
24
10655
20
36
34
04056
1860
1884
1234
1240
1240
1252
1916
1891
1256
1256
1253
1256
1256
1256
1256
1256
1252
1246
1209
02053
1922
1913
1920
1920
1921
1925
1927
1928
1928
1924
1911
6
444
6
452
03050
9277
6
9286
8
9283
8
9272
8
9243
12
9182
14
9165
14
9089
14
9269
9267
9263
9248
9225
9212
9096
03052
7502
6
7502
8
7501
8
7492
8
7486
10
7416
10
7380
10
7300
10
7496
7496
7490
7479
7468
7458
7361
01036
Tabel A5: Coverage van de C-residu’s op de sense en antisense streng in de patiëntenstalen. De eerste 5 patiënten ondergaan geen therapie,
de overige 11 nemen medicatie om de virale replicatie tegen te gaan.
79
80
Figuur A11: Heatmap van de methylatie in de patiëntenstalen; sense en antisense streng. Voor
elke locatie van een CpG in HXB2 binnen de gesequeneerde regio is het methylatiepercentage
weergegeven. Links van de zwarte lijn zijn de patiënten die op het moment van de staalname
geen therapie ondergingen; de patiënten die op het moment van de staalname wel therapie kregen
staan rechts van de zwarte lijn.
81
Tabel A6: Differentiële methylatie tussen patiënten die geen therapie ondergaan ten opzichte
van patiënten op therapie; sense en antisense streng. De vetgedrukte locaties vertonen significante verschillen op het 5% significantieniveau.
Locatie
HXB2
566
640
644
661
662
687
688
690
691
699
700
712
713
714
715
718
719
728
729
735
736
738
739
751
752
770
771
797
798
803
804
816
817
p
q
3.48E-01
1.78E-03
1.29E-02
0.00E+00
3.78E-01
0.00E+00
6.73E-01
0.00E+00
6.73E-01
0.00E+00
9.42E-01
0.00E+00
9.87E-01
0.00E+00
9.38E-01
4.65E-01
4.90E-01
0.00E+00
9.18E-01
0.00E+00
7.36E-01
1.02E-10
8.98E-01
1.06E-11
4.63E-01
0.00E+00
6.89E-01
0.00E+00
1.00E+00
0.00E+00
1.00E+00
0.00E+00
1.00E+00
6.75E-01
3.91E-03
2.66E-02
0.00E+00
6.93E-01
0.00E+00
9.47E-01
0.00E+00
9.47E-01
0.00E+00
1.00E+00
0.00E+00
1.00E+00
0.00E+00
1.00E+00
7.67E-01
7.71E-01
0.00E+00
1.00E+00
0.00E+00
9.72E-01
2.40E-10
1.00E+00
2.69E-11
7.67E-01
0.00E+00
9.47E-01
0.00E+00
1.00E+00
0.00E+00
1.00E+00
0.00E+00
1.00E+00
Differentiële
methylatie (%)
1.250
-10.526
9.722
-0.992
-6.464
-1.501
3.214
-3.128
3.214
-3.252
0.561
-3.508
-0.123
2.013
-0.606
0.020
-5.373
2.199
0.758
2.328
2.404
1.226
0.916
-0.715
-4.957
-2.849
-2.739
-1.067
0.000
-1.073
0.000
-0.964
0.000
82
Tabel A7: Differentiële methylatie tussen patiënten die minder dan drie jaar therapie ondergaan
ten opzichte van patiënten die meer dan drie jaar op therapie ondergaan; sense en antisense
streng. De vetgedrukte locaties vertonen significante verschillen op het 5% significantieniveau.
Locatie
HXB2
566
640
661
687
690
699
712
714
718
728
729
735
736
738
739
751
752
770
771
797
798
803
804
816
817
p
q
3.01E-01
1.00E+00
1.60E-01
1.57E-01
5.48E-01
6.04E-02
1.06E-01
2.41E-02
0.00E+00
6.12E-01
1.00E+00
9.37E-01
5.14E-01
3.34E-01
7.67E-01
2.57E-03
7.05E-01
1.01E-02
6.00E-01
7.02E-14
1.00E+00
4.07E-01
1.00E+00
3.18E-02
1.00E+00
6.83E-01
1.00E+00
3.99E-01
3.99E-01
8.99E-01
2.16E-01
3.31E-01
1.21E-01
0.00E+00
8.99E-01
1.00E+00
1.00E+00
8.99E-01
6.97E-01
1.00E+00
2.14E-02
9.79E-01
6.32E-02
8.99E-01
8.77E-13
1.00E+00
7.82E-01
1.00E+00
1.32E-01
1.00E+00
Differentiële
methylatie (%)
2.500
0.000
0.108
-0.202
0.169
0.530
-0.463
-0.586
-0.416
0.133
0.000
0.021
5.819
0.253
2.679
0.430
3.361
-0.739
4.580
0.605
0.000
-0.066
0.000
0.160
0.000

Methylatie profilering van HIV om de epigenetische

Related documents

Products

Support

Methylatie profilering van HIV om de epigenetische

Related documents

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib